核酸检测的自我鉴定6篇核酸检测的自我鉴定 DNA的定量和纯度测定实验目的：学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法测定DNA含量和纯度的基本原理 紫外分光光度法（此法要求核下面是小编为大家整理的核酸检测的自我鉴定6篇,供大家参考。
篇一：核酸检测的自我鉴定
A的定量和纯度测定实验目 的：学习 并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法测定DNA含量和纯度的基本原理 紫外分光光度法（ 此法要求核酸纯度很高， 1个Abs相当 于50ug/ml双螺旋DNA, 除了 定量测定以外还可进行核酸纯度的检测， A260/A280比值， 纯的DNA为1. 8， RNA为2. 0， 样品中含有蛋白质和苯酚时，A260/A280比值降低。
） 定糖法（ DNA糖部分为脱氧核糖， RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（ 核酸的磷酸部分）DNA测定的方法原理
二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下加热， 其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂， 生成嘌呤碱、 脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸， 而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω -羟基-γ -酮基戊糖， 与二苯胺试剂反应生成蓝色物质， 在595nm波长处有最大吸收。
DNA在40~400μ g范围内， 光吸收与DNA的浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
实验内 容
DNA标准曲线的制作和样品测定试剂管号0对照12345样品1样品2DNA标准溶液,ml0.00.40.81.21.62.02.02.0蒸馏水， ml2.01.61.20.80.4000二苯胺试剂,ml4.04.04.04.04.04.04.04.0OD595注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内 。样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。按上表加完各试剂后， 充分混匀。
于60℃水浴中保温1h， 冷却后于595nm波长处以0管为空白调零， 测定各管光密度（ OD595nm）
。
以DNA的含量为横坐标， 光密度（ 吸收值）
为纵坐标， 绘制标准曲线。
DNA含量计算
篇二：核酸检测的自我鉴定
章 核酸的提取与鉴定第一节核酸提取提取核酸的种类：基因组DNA质粒DNA总RNAmRNA
核酸提取的总原则⒈保证核酸一级结构的完整性；⒉防止污染（蛋白质、 多糖、 有机溶剂等）
；⒊防止核酸降解；
核酸提取的基本步骤⒈ 破碎细胞；⒉ 除去其他生物分子；⒊ 分离核酸；⒋ 除去杂质；⒌ 鉴定和储存
一、 质粒DNA的提取质粒：
游离于细菌染色体之外的遗传物质，特点：闭环双链DNA1~300kb能够复制
质粒DNA提取的基本步骤：⒈ 培养细菌和扩增质粒⒉ 收获细菌和溶菌⒊ 提取质粒
⒈ 培养细菌和扩增质粒培养条件：
37℃， 液体培养基中， 1 50-250r/mi n的摇床旋转的条件下培养细菌；为增加质粒拷贝数可加入氯霉素；生长情况：大肠杆菌每20mi n分裂1次， 直到最大密度
⒉ 收获细菌和溶菌收获细菌：
离心收集细菌细胞沉淀 ， 弃上清培养液；
溶菌：
破坏细胞壁和细胞膜机械法：
超声波、 捣碎机、 匀浆器等；1.溶菌酶：
破坏细胞壁溶菌酶-化学试剂联合法：3. 去污剂：
SDS(十二烷基硫酸钠) ；Tri ton X-1 00（曲拉通X-100）
等，作用：
溶解细胞膜。2. EDTA(乙二胺四乙酸盐) ：
螯合Ca2+(维持细胞壁必需)
⒊ 提取质粒: 去除染色体DNA原理：1 . 质粒DNA和染色体DNA的分子大小不同：质粒DNA分子量小2. 质粒DNA和染色体DNA的结构不同：染色体DNA断裂成线状片断质粒DNA环状DNA
提取方法：⑴ 氯化铯密度梯度分离法方法：
细菌裂解液+氯化铯+溴化乙锭（EB）超速离心
氯化铯密度梯度离心
溴化乙锭（EB）
：
降低线形DNA的密度
⑵ 碱裂解法pH>1 2（NaOH和SDS）染色体DNA片段变性解链；质粒DNA部分解链将pH调回中性(乙酸钾)变性的染色体DNA片段相互缠绕，且与蛋白质结合沉淀；离心上清液：
质粒DNA；沉淀：
染色体DNA和蛋白质；
⑶ 煮沸裂解法加热：
使蛋白质和染色体DNA变性降温：
质粒DNA复性， 染色体DNA不能复性
二、 真核生物基因组DNA
组织DNA的提取（SDS/酚法）原理：
SDS裂解细胞， 然后用酚使蛋白质变性，与水溶性DNA分离。水相（DNA）中间层（变性蛋白质）有机相
组织DNA的提取过程(4℃/灭菌器皿)匀浆组织SDS蛋白酶KEDTA酚/氯仿抽提蛋白质变性提取DNA乙醇沉淀重新溶解DNA(TE缓冲液)分离组织细胞离心取上层水相水相/有机相裂解细胞降解蛋白质抑制DNase
三、 真核生物RNARNA提取的关键：
建立一个无RNase的环境RNase的特点：
分布广、 耐高温具体操作：⒈玻璃器皿：
200℃， 烘烤4小时；⒉使用一次性无RNase的塑料制品；⒊溶液：
用0. 1 % DEPC水配制及未开封试剂配制；⒋操作人员戴一次性口罩和手套；⒌操作环境：
超净台、 冰浴；
匀浆组织4℃/细胞裂解液（异硫氰酸胍、 巯基乙醇、 SDS等）苯酚/氯仿抽提乙醇沉淀重新溶解RNA(DEPC水)㈠总RNA的提取：热酚法取上层水相离心
㈡mRNA的提取Ol i go(dT) -柱层析法原理：
真核mRNA3`端具有pol y(A)利用具有Ol i go(dT) -层析柱分离；
四、 核酸纯度鉴定方法：
紫外吸收法核酸浓度测定：1 OD值相当于50µg/ml 的双链DNA相当于40 µg/ml 的单链DNA或RNA核酸浓度计算公式：双链DNA浓度(µg/ml ) =OD260× 稀释倍数×50/1 000单链DNA或RNA浓度(µg/ml ) =OD260×稀释倍数× 50/1000
核酸纯度测定：DNA样品：
OD260/OD280≈1.8RNA样品：
OD260/OD280≈1.8-2.0
第二节核酸凝胶电泳电泳：
带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象；
+-双链DNA的电泳负极到正极：
分子量由大到小
根据支持物分为：一、 琼脂糖凝胶电泳二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的分类
电泳槽（垂直和水平）电泳仪电泳装置
一、 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是红色海藻产物琼脂中提取的一种多糖，加热到沸点后再冷却凝固就形成了良好的电泳介质；主要试剂：琼脂糖电泳缓冲液：
TBE(Tris、 硼酸、 EDTA)上样缓冲液：
溴酚蓝、 二甲苯青、 蔗糖染色剂：
溴化乙锭
操作：⒈选择琼脂糖种类、 确定浓度(根据核酸分大小)；
琼脂糖凝胶浓度(%) 分离DNA的有效范围(Kb)0.35~600.61 ~200.70.8~1 00.90.5~71 .20.4~61 .50.2~32.00.1 ~2琼脂糖凝胶浓度与分离DNA的有效范围
⑴加缓冲液⑵加热：
90度左右⒉制胶
⑶灌胶， 插入梳子（冷却40-45度后凝固 ）
；⑷将凝胶置于电泳槽中；⑸加入电泳缓冲液， 拔出梳子
⒊上样：
样品与上样缓冲液混合， 加入胶孔中；⒋接通电源， 进行电泳；
上样缓冲液的作用（监测电泳的进程； 增加样品密度）溴酚蓝(200bp)二甲苯青(1600bp)1.4%琼脂糖凝胶
⒌染色：溴化乙锭：
一种荧光染料，和双链DNA结合后， 在紫外光照射下发橙黄色荧光；
⒍检测：
紫外透射仪、 凝胶呈像分析系统
凝胶电泳的应用⒈核酸分子量的检测
⒉鉴别分子量相同而构型不同的DNA分子
⒊RNA样品质量的检测28SrRNA1 8SrRNA
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶：
由丙烯酰胺和N,N`-甲叉双丙烯酰胺在TEMED和过硫酸铵的催化下聚合而成。特点：凝胶孔径较小；分辨率高（相差一个bp的DNA）
；适合分离5-500bp的DNA；
聚丙烯酰胺凝胶电泳分类变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离单链DNA）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离双链DNA）连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
第三节DNA测序一、 Sanger双脱氧链终止法二、 Maxam-Gi l bert化学降解法三、 DNA测序自动化
一、 Sanger双脱氧链终止法⒈建立体外DNA合成体系：待测序DNA标记引物DNA聚合酶4种dNTPddNTP
⒉调整dNTP和ddNTP的比例， 新合成的DNA链可能在任何位置加入ddNTP， 导致合成终止， 得到一系列长度不同的DNA片段
⒊变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离合成的DNA片段⒋放射自显影读出DNA序列（和待测DNA互补）
二、 Maxam-Gi l bert化学降解法⒈制备标记片断（四个化学降解反应体系）反应体系碱基修饰试剂硫酸二甲酯 甲基化脱G 六氢吡啶 GG+A 甲酸脱A/G碱基修饰反应主要断裂试剂断裂点G六氢吡啶 G+AC+T肼C/T开环六氢吡啶 C+TC肼+盐C开环六氢吡啶 C
⒉读序
三、 DNA测序自动化
篇三：核酸检测的自我鉴定
的分离纯化和鉴定 核酸包括DNA、 RNA， 在细胞中都与蛋白质结合而存在。 分离纯化核酸总的原则 :1 、 保证一级结构的完整性， 完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础；减少化学、 物理、 生物因素对核酸的降解：避免过酸、 过碱对磷酸二酯键的破坏；避免机械剪切力以及高温煮沸；抑制DNase或RNase的活性；2、 排除蛋白质、 脂类、 糖类等分子的污染。
真核DNA提取的主要步骤真核生物的一切有核细胞（ 包括培养细胞）
都可以用 来制备基因组DNA。 温和裂解细胞， 溶解DNA， 使DNA与组蛋白分离； 采用 化学或酶学方法去除蛋白质、 RNA及其他大分子。
外周血白细胞DNA的提取（ NaI法）原理利用 双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜， 释放出血红蛋白及细胞核， NaI破核膜并有效解离DNA-蛋白质复合物， 使核酸处于易提取状态，再以氯仿/异戊醇抽提（ 蛋白质变性沉淀并溶解脂类， 异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生）
， 离心后DNA存在于上层水相中， 以37%异丙醇沉淀及洗涤DNA， 即获得白细胞DNA。
用 此法提取的DNA可用 于Southern 杂交、 PCR的模板等。
【试剂】1． 6 mol/L NaI 2． 氯仿/异戊醇(24: 1 V/V) 混合液， 应在棕色密封瓶中保存。3． 异丙醇（ isopropanol）
(A. R)4． 37% 异丙醇或70%乙醇5． 双蒸水(ddH2O)
(高压灭菌)6． TE缓冲液 (pH 8. 0)
(10 mmol/L Tris-Cl、 1 mmol/L EDTA)
高压灭菌。
操作步骤1.取新鲜抗凝血100μ l置Ep管中,
离心10000rpm× 1 min。2.弃上清， 加ddH2O 200μ l,
摇匀20s。3.加6mol/L NaI 200μ l,
缓慢倒置摇匀 20s。4.于管内 加氯仿/异戊醇(24: 1) 400μ l,
缓慢颠倒混匀两相， 离心10 000rpm× 10min。5.吸取上层水相350μ l置一新Ep管中， 加纯异丙醇200μ l,
混匀 。6.室温放置15min,
离心14 000rpm× 12min。
Water phase (DNA)Water phase(DNA)proteins
precipitatechloroform /isoamyl alcohol (lipids)STEP 5
7.小心弃去上清， 再加37%异丙醇（ 或70%乙醇）
1 ml(勿摇动) ， 离心14000rpm× 12min.8.小心弃异丙醇（ 或乙醇）
， 于室温敞口 放置直至可见的痕量液体挥发殆尽。9.加50μ l TE缓冲液溶解DNA,
以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。
1.标本必须新鲜， 提取前细胞应保持完整。
所用 Ep管、 滴头等用 品及ddH2O、 试剂等应高压灭菌， 操作尽量在4℃以下进行。2.混匀试剂、 吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。3.弃去异丙醇时动作应轻， 切忌甩干， 以免DNA丟失。4.0. 54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、 tRNA及多 糖不产生沉淀。
一般不需在低温条件下长时间放置。
其缺点是易使盐类与DNA共沉淀； 在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去， 所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。5.室温下放置16h或65℃放置1h,
可加快基因组DNA沉淀的溶解。【注意事项】
核酸的鉴定与分析 紫外分光光度法可用 于确定核酸的浓度及纯度。 核酸的分级分离。
层析技术及凝胶电泳法， 凝胶电泳分离法分制备型和分析型， 根据分离核酸片 段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 核酸杂交技术用 于鉴别某个特定的片 段。 多 聚酶链反应（ polymerase chain reaction,
PCR）对目 的基因进行DNA序列分析及鉴定 。 DNA测序 基因表达分析（ RNA详细结构和数量的分析）
DNA的鉴定一、 紫外法测DNA的纯度及浓度原理：组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性， 最大吸收峰在260nm， 这是紫外测定核酸的基础。
蛋白质在280nm处有最大的吸收峰， 盐和小分子则集中在230nm处。
OD值为1时相当于大约50μ g/ml双链DNA 。
通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。
紫外法仅用 于测定浓度大于0. 25μ g/ml的核酸溶液。
操作取15μ l DNA样品于3ml双蒸水中， 分别于260、 280、 230nm处比色并记录。定量分析：DNA＝ A260× 核酸稀释倍数(3000/15) × 50/1000=10× A260(ug/ul)纯度分析：DNA
A260/A280=1. 8A260/A280>1. 8， 有RNA杂质， 用 RNase消化；A260/A280<1. 7, 有杂蛋白， 重复抽提纯化步骤;A260/A230<2. 0， 可能有盐未除尽。注：
此法不能区分DNA和RNA， 不能用 于核酸粗制品的测定。
核酸凝胶电泳 核酸是带均匀负 电荷的分子， 在电场中向正极移动， 不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同， 在自 由泳动时， 各核酸分子的迁移率区别很小， 难以分开。
以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质， 具有分子筛效应， 使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异， 达到分离的目 的， 此为分离、 鉴定和纯化核酸片 段的标准方法。
DNA的琼脂糖凝胶电泳原理 DNA分子带负 电荷， 在电场中受到电荷效应、 分子筛效应向正极移动过程中,
因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异， 对于线形DNA分子， 其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。
电泳时加溴化乙锭（ EB）
， 其与DNA结合形成一种荧光络合物， 在254－ 365nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光， 可用 于检测DNA。
【试剂与材料】1． 5× TBE缓冲液(pH 8. 3) ：
54 g Tris碱,
27. 5 g硼酸,
20 ml 0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0) ,
加水至1 L。2． 0. 5× TBE缓冲液 (pH 8. 3)3． 溴化乙锭(EB) ：5 mg/ml4． 1－ 2% 琼脂糖凝胶:
琼脂糖1－ 2 g加至100 ml 0. 5× TBE缓冲液,
加热熔解备用 。5． 6× 凝胶上样缓冲液：
0. 25%溴酚蓝， 0. 25%二甲苯青FF， 30%甘油溶于水中， 4℃保存。6． DNA分子量标准
【操作步骤】1． 琼脂糖凝胶板的制备：
将1%－ 2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀， 冷却到65℃加EB至终浓度0. 5μ g/ml， 倒入凝胶槽， 厚度约3－ 5mm， 放置样品梳， 待冷却成形后取出梳子及隔板， 放入水平电泳槽中， 缓冲液淹没过胶1－ 2mm为止。2． 加样：
样品中加1/5体积的6× 凝胶上样缓冲液， 混匀， 取15μ l加入凝胶点样孔中。
同时要设立合适的DNA分子量标准物。3． 电泳：
电压2－ 10V/cm 胶,
待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时， 关闭电源。4． 取出凝胶块， 置紫外透射反射分析仪上观察， 即可见桔红色的DNA区带。
【注意事项】1． 加样时勿破坏样品孔， 否则DNA带型不整齐。2． 上样缓冲液中适量的甘油， 蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度， 使样品均匀沉到样孔底， 而溴酚蓝、 二甲苯青可使样品带色， 便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。3． EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性， 应戴手套操作， 对于含有EB的溶液用 后应妥善净化处理。4． 电泳过程中， EB向阴极移动， 延长电泳时间， EB会从凝胶中迁移出来， 从而使小片 段DNA难于检测， 可将凝胶浸在0. 5 μ g/ml EB溶液中重新染色后检测。5． 加样孔的加样量依DNA样品中片 段的数量及大小而定， 通常对0. 5cm宽的加样孔， DNA上样量在0. 1－ 0. 5μ g即可有良好的观察效果。6． 小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快， 常用 于快速分析。
小胶通常要在高电压下电泳(＞ 10 V/cm) 。
应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。
思考题1、 分离核酸的基本原则包括哪两方面？2、 试比较用 EB进行DNA凝胶电泳前（ 加在上样缓冲液中）
、 电泳中（ 加在凝胶中）
、 电泳后（ 凝胶浸泡于EB溶液中）
的染色过程， 各有何有优缺点？
篇四：核酸检测的自我鉴定
09 年第 8 期《湖北畜牧兽医》月 刊邮发代号 38-352HUBEI JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY SCIENCES核酸通常与蛋白 质结合形成核蛋白 存在于细胞中， 是生命的基本物质之一， 具有储存、传递生物体遗传信息的功能，也是蛋白 质合成不可缺少的物质， 在生物的生长、遗传、变异等生命过程中起着重要的决定作用。核酸分为两大类—核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。核酸的基本组成单位是核苷酸， 是由 众多的核苷酸缩合而成的多聚核苷酸。
核苷酸经过水解可以得到含氮碱、戊糖和磷酸。真核生物基因组 DNA 和 RNA 广泛应用 在动、植物的遗传育种基因图谱的构建、品种鉴定、物种形成和系统演化等方面的研究中， 无论是基因工程， 还是蛋白 质工程， 核酸分子都是这些技术应用所涉及的主要对象， 所以 DNA 和 RNA 的分离与提取是分子生物学研究中重要的基本技术［1］。1材料和方法1．1材料供试材料为冷冻的新鲜剪碎猪肝 4g［2］。
所用 试剂为 SC 缓冲 溶液：2．94g 柠檬酸钠 和 9．0g氯化钠溶于 1L 蒸馏水（用盐酸调 pH 值至 7．0）；5％ SDS 溶液； 地衣酚试剂：
先配制 0．1％三氯化铁的浓盐酸溶液， 实验前以此溶液为溶剂配成 0．1％地衣酚溶液； 氯化钠；95％冷乙醇； 氯仿； 异戊醇。1．2猪肝 DNA 和 RNA 的提取1．2．1DNA 的提取①取新鲜猪肝捣碎液， 装入离心管， 平衡，4 000r/min 离心 10min， 除去上层； ②下层加入 SC 溶液5mL 混匀 ， 同上离心， 除去上层；③下层沉淀转移入三角 瓶，加入 SC 溶液 20mL，SDS 溶液 3mL 混匀 ，5mL 氯仿 ／异戊醇混匀 ， 固体氯化钠 2g 边加边混， 充分振荡 30min，4 000r/min离心 20min； ④小 心取出 离心管， 观察有 3 层， 取出 上层水相； 水相加入等体积氯仿 ／异戊醇振荡 10min，4 000r/min 离心 20min；⑤取上清， 加等体积 95％冷乙醇， 边加边顺一个方向搅， 玻璃棒上缠绕的 DNA 用少量 80％乙醇洗一次， 置小离心管于 4℃冰箱中待用［3，4］。1．2．2RNA 的粗提①接上面的第一步， 在上清中加入等体积的氯仿/异戊醇置于带塞烧瓶中振荡， 冰浴 30min；②将混合物转移至 1.5mL EP 管中，4℃、12 000r/min 离心 15min，将上清液移至另 一 EP 管中； 加异丙醇， 在冰上放置 15min，3 000r/min 离心 10min， 得到 RNA 沉淀［5，6］。1．3核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色D－核糖核酸＋浓盐酸＋地衣酚———反应显绿色—反应显蓝紫色D－2－脱氧核糖核酸＋酸＋二苯胺——1．3．1 DNA 显色1mL SC 溶液溶解 DNA， 然后转移到 50mL离心管中， 用 9mL 0．01mol／L NaOH 溶液溶解，4 000r/min 离心 10min， 上清转移到试管中备用。
各取上述 1mL DNA 溶液于两只试管中， 其中一只里面加入 3mL 地衣酚试剂， 然后置沸水中 20min， 观察颜色反应； 另 外一只试管中加入 2mL 二苯胺试剂 ，60℃条件下反应 1h， 观察颜色反应。1．3．2RNA 显色将 RNA 沉淀用 2mL 蒸馏水溶解， 然后转移至 2 只试管中， 每只 1mL。
其中一只试管中加入 3mL 地衣酚试剂， 然后置沸水中 20min， 观察颜色反应； 另 外一只 试管中加入2mL 二苯胺试剂，60℃条件下反应 1h， 观察颜色反应。1．4核酸的定量和纯度测定紫外分光光度法 （此法要求核酸纯度很高，1 个吸光度值相当于 50μg／mL 双螺旋 DNA； 除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260／A280比值， 纯的 DNA 为 1．8，RNA 为2．0， 样品中含有蛋白 质和苯酚时，A260／A280比值降低。
）； 定糖法（DNA 糖部分为脱氧核糖，RNA 糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法）； 定磷法（核酸的磷酸部分）。1．4．1二苯胺显色法原理DNA 在酸性条件下其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂， 生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸， 而 2－脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω－羟基－γ－酮基戊糖， 与二苯胺试剂反应生成蓝色物质， 在 595nm收稿日 期：2009－05－20作者简介：
周之超（1989－）， 男， 湖北汉川 人， 在读本科生， （电话）13545375310（电子信箱）zzc19890415＠126．com。猪肝组织核酸的分离纯化及鉴定周之超， 石明明（武汉大学生命科学学院生物学基地班， 武汉430072）摘要：
利用盐溶法分离制备动物基因组 DNA 和 RNA 的方法， 并对实验过程进行改良和分析。实验中选用新鲜猪肝作为实验材料， 根据核糖核蛋白 与脱氧核糖核蛋白 在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离， 利用 SDS 裂解， 氯仿、异戊醇抽提， 分离得到猪肝脏中基因组 DNA 和 RNA； 同 时， 通过脱氧核糖和核糖的显色反应定性区分了DNA 和 RNA； 实验最后利用紫外分光光度法和二苯胺法定量测定了 DNA 样品中的 DNA 的含量。关键词：
核酸；DNA；RNA； 地衣酚显色法； 二苯胺显色法中图分类号：Q503；Q52文献标识码：A文章编号：1007－273X（2009）08-0007-037
2009 年第 8 期HUBEI JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY SCIENCES波长处有最大吸收（见图 1）［5］。
DNA 在 40～400μg 范围内 ， 光吸收与 DNA 的浓度成正比。
在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。1．4．2DNA 吸光度的测定①A260测定：
以 H2O 作为空白 ，取上清测 A260值后确定稀释倍数， 使 A260值在 2．0 左右（DNA此时的浓度约为 100μg／mL。
（由 于二苯胺法的测定范围是40~400μg／mL DNA， 所以 DNA 浓度如果太小会影响测定结果）。
②A280测定：A260／A280比值计算。
纯的 DNA 为 1．8，RNA为 2．0。
如果样品中混有 RNA， 则比值大于 1．8； 如果样品中混有蛋白 质， 则比值小于 1．8。所用的 DNA 溶液为前面提取后溶解的 DNA 样品。1．4．3DNA 标准曲线的制作和样品测定DNA 标准曲 线的制作加样见表 1。按表 1 加完各试剂后， 充分混匀 。
于 60℃水浴中保温1h， 冷却后于 595nm 波长处以 0 管为空白 调零， 测定各管光密度（OD595）。以 DNA 的含量为横坐标， 光密度（吸收值）为纵坐标， 绘制标准曲线。
（注：
待测溶液中的 DNA 含量应调整至标准曲线的可读范围内 。
样品 1 和样品 2 为不同稀释倍数的DNA 溶液。
）1．4．4DNA 含量计算以样品的光密度， 根据标准曲 线计算出 相对应 DNA 含量， 并同紫外法测定的值进行比较。
（注：二苯胺试剂具有腐蚀性， 且二苯胺反应产生的蓝色不易 褪色， 操作中应防止洒出 ； 比色时， 比色杯外面一定要擦干净。
）2结果与分析2．1猪肝 DNA 及 RNA 的分离提取2．1．1核酸分离的原则核酸存在于多种细胞， 因 此， 分离方法复杂多样。
因各种 DNA、RNA 含量的差异、核酸的纯度及量的要求不同， 因此， 在实验前应对所采用 的方法有所选择。
总的说来， 核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上， 利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液， 即水相）， 分离， 纯化； 利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀， 收获核酸。2．1．2DNA 和 RNA 分离的 基本原理根据核糖核蛋白 与脱氧核糖核蛋白 在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离， 然后用 蛋白 质变性沉淀剂去除蛋白 ， 使核酸释放出 来， 再利用 核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出 ， 达到分离DNA 和 RNA 的目 的。在 0．14mol／L 的氯化钠溶液中 ，RNA 核蛋白 溶解度大，而 DNA 核蛋白 溶解度小； 相反在 1mol／L 的氯化钠溶液中，DNA 核蛋白 的溶解度大， 而 RNA 核蛋白 的 溶解度小， 从而使 DNA 和 RNA 核蛋白 分开。2．1．3核酸分离的一般步骤①溶解细胞：
溶解细胞的方法（sodium dodecyl sulfate，SDS）
加包 括 十 二 烷 基 硫 酸 钠NaOH、蛋白 酶和用超声波破碎等方法。
②有机溶剂抽提：
利用 SDS 溶液提取的 目 的 是使蛋白 质变性沉淀于有机相 ， 而核酸保留在水相， 达到分离核酸的目 的。
③沉淀：
为了除去分离过程中残留的有机溶剂， 常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸， 再通过离心回收核酸， 然后用 80％乙醇洗涤沉淀， 除去多余的盐， 以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。试剂盒：
目 前开发了许多商品化的核酸分离柱， 可简单、快速地分离得到纯度很高的 DNA 或 RNA， 其分离原理有的是利用核酸的分子量差异， 有的是利用 所需分离的核酸的特点将其特异性结合达到分离、回收的目 的。
④传统的酚、氯仿、异戊醇在抽提中的作用 ：a.酚：
有效的使蛋白 质变性， 不能完全的抑制 RNA 酶的活性， 能溶解带有长 poly（A）的 RNA 分子。使用前必须用水饱和并用 Tris 平衡至 pH＞7．8， 以防止 DNA分配到有机相。
结晶酚要在 182℃下重蒸去除醌类等氧化产物， 这些物质能够引 起磷酸二酯键的断裂或促进核酸交联。b.氯仿：
纯酚的比重为 1．07， 有机相和水相有时很难分开。
加入氯仿（比重为 1．47）可以避免这一问题。
同时， 酚有时会微溶于水。
可以用氯仿将水相中的酚去除。
c.异戊醇：
减少泡沫的产生。2．2核糖核酸和脱氧核糖核酸的显色实验DNA 脱氧核糖的显色反应中加地衣酚试剂的试管反应后呈茶色， 加二苯胺试剂的试管反应后呈蓝色。
反应机理是DNA 分子中 2－脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解， 产生2－脱氧核糖并形成 ω－羟基－γ 酮基戊醛， 后者与二苯胺试剂反应成蓝色化合物， 其反应为：DNA→ω－羟基－γ 酮基戊醛→蓝色复合物， 所以我们的结果与理论是一致的 ， 对于加入地衣酚的试管， 我们认为地衣酚主要是与 RNA 发生反应， 所以我们看到 的 茶色可能只 是地衣酚加 热 后 的 颜色 ， 或 者是DNA 溶液和地衣酚加热后的共同的颜色。RNA 核糖的显色实验结果表明 加地衣酚试剂的试管反应后呈浅绿色， 加二苯胺试剂的试管反应后呈黑色。
RNA 与浓盐酸共热时发生降解， 产生的核糖又可转变糖醛， 在 FeCl3或 CuCl2催化下， 糖醛与 3，5－二羟基甲 苯（地衣酚、苔黑酚）反应形成绿色复合物， 实验结果观察到为浅绿色， 符合理论结果， 颜色稍浅， 可能是浓度过低， 试液被稀释的结果， 或者是酸度不够没有加催化剂的影响。
对于加入二苯胺试剂的试管， 我们认为二苯胺试剂主要是与 DNA 发生反应， 所以我们看到的黑色可能只是二苯胺试剂加热后的颜色。2．3核酸的定量和纯度测定2．3.1DNA 标准曲 线的制作和样品测定按照表 1 的顺序加入样品 反应得到 DNA 标准曲 线样品 测 定的 结果 （ 见表2）， 以 DNA 的含量为横坐标， 光密度（吸收值）为纵坐标， 绘制标准曲线（见图 2）。2．3．2DNA 含量的 计算由 图 2 所作的 DNA 标准曲 线可知，DNA 含量与 OD595的关系为：图 1二苯胺显色法原理图表 1DNA 标准曲线的制作加样表试剂DNA 标准溶液（200mg ·mL-1）/mL蒸馏水/mL二苯胺试剂/mL0（对照）0.02.04.010.41.64.020.81.24.031.20.84.041.60.44.052.00.04.0样品12.00.04.0样品22.00.04.0管号【试验研究】8
2009 年第 8 期《湖北畜牧兽医》月 刊邮发代号 38-352HUBEI JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY SCIENCESOD595＝0．0022×c（DNA）浓度实验中样品 1 为 DNA 原液， 样品 2 为稀释 1 倍的 DNA溶液。
将 OD595值 0．274 和 0．174 分别 代入上面的 公式， 可求得样品 1、 样品 2 中的 DNA 含量分别为 124．54μg／mL 和79．09μg／mL。
由 紫外分光光 度法 得 ，1 个吸光 度值相 当 于50μg／mL 双螺旋 DNA，我们测得稀释一倍的 DNA 溶液吸光度值为 1．734， 所以其 DNA 含量为 50μg／mL×1．734＝86．7μg／mL，则原液 DNA 含量为 86．7μg／mL×2＝172．4μg／mL。由实验结果得知， 通过 DNA 标准曲 线测得的 DNA 含量比紫外分光光度法测得的值要低， 由于而在我们的实验过程中很难保证这一点， 所以我们认为通过 DNA 标准曲 线测得的 DNA 含量值更为可信。
而且， 紫外分光光度法对核酸纯度要求很高， 但测得的 A260／A280比值为 1．727， 纯的 DNA 为1．8， 说明 样品 中混入了 蛋白 质， 可能是在 DNA 的 分离纯化中， 没有将蛋白 质除尽的缘故。3讨论（1）
在细胞内 的 核酸通常是与蛋白 质形成复合物而存—核糖核蛋白 和脱氧核糖核蛋白 。
核蛋白 在水溶液和各在——种电解质溶液中有一定的溶解度， 所以在前面研磨步骤将损失一部分核酸。
因此应避免加入大量的水进行研磨， 以减少核蛋白的溶解。（2）
核酸酶降解核酸所带来的 误差。
脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的存在导致了一些核酸降解成为了 核苷酸， 在水中溶解后被弃去。
防止该误差的主要方法有两种， 一是选取核酸酶含量较低的材料， 如小牛胸腺细胞等； 二是降低酶活性， 保证操作在低温下进行， 以此来抑制酶的活性。（3）在碱性溶液中溶解 RNA 后加 HCl 时， 溶液呈酸性，有小部分 DNA 此时也被水解掉了 。
可以之前利用氯仿－异戊醇法或苯酚法去除蛋白 质， 然后在溶解 RNA 后就可以直接把上清液分离出 来。地衣酚法测 RNA 反应原理是：
当 RNA 与浓盐酸共热时．即发生降解．形成的核糖继而转变成糠醛， 后者与 3，5－二羟基甲 苯（地衣酚 orcinol）反应， 在 Fe2＋或 Cu2＋催化下， 成鲜绿色复合物， 反应产物在 670nm 处有最大吸收。
所以， 地衣酚法特异性差， 凡戊糖均有此反应， 己糖持续加热产生的羟甲基糠醛， 以及 DNA 和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。
另 外，RNA 浓度在 10~100μg／mL 范围内 ， 光吸收与RNA 浓度成正比， 其中所用 标准液浓度为 100μg／mL， 笔者认为采用 50μg／mL，RNA 待测液浓度再稀释一倍， 所测结果再利用线性关系计算会更准确些［4］。（4）提取基因组 DNA 要保证其一级结构的完整性， 排除其他生物大分子（蛋白 质、多糖、脂类等）以及 RNA 分子的污染， 并且不存在过高浓度的有机溶剂和金属离子， 以避免化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏和对后续的酶反应产生抑制作用； 同时， 应尽量简化操作步骤， 以减少提取过程中有害因 素对核酸的 破坏。
该试验使用 SDS 破坏细胞膜、核膜， 使蛋白 质变性， 有效去除核酸分子结合的蛋白 质， 从而游离出 核酸， 它主要用来抑制核酸酶的活性， 避免 DNA 被降解； 加入氯仿也是为了 使核蛋白 变性， 促使 DNA 分子释放，有效抑制核酸酶活性， 去除带有 poly（A）长链的 RNA。
该试验所用试剂均为常见的化学试剂， 不需要昂 贵的生物试剂；试验仪器要求低， 操作简单， 完成一...
篇五：核酸检测的自我鉴定
的分离纯化和鉴定 核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而存在。
分离纯化核酸总的原则 : 1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸
结构和功能的基础；
减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：
避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；
避免机械剪切力以及高温煮沸；
抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
真核DNA提取的主要步骤
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都 可以用来制备基因组DNA。
温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子。
外周血白细胞DNA的提取 （NaI法）
原理
利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核， NaI 破核膜并有效解离 DNA- - 蛋白质复合物，使核酸处于易提取状态，
再以氯仿/ / 异戊醇抽提（蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生），离心后 DNA 存在于上层水相中，以 37%异丙醇沉淀及洗涤 DNA ，即获得白细胞 DNA 。用此法提取的 DNA 可用于 Southern 杂交、 PCR 的模板等。
【试剂】
】
1．6 mol/L NaI
2．氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中保存。
3．异丙醇（isopropanol）(A.R) 4．37% 异丙醇或70%乙醇 5．双蒸水(ddH 2 O) (高压灭菌) 6．TE缓冲液 (pH 8.0)
(10 mmol/L Tris-Cl、1 mmol/L EDTA) 高压灭菌。
操作步骤
1. 取新鲜抗凝血100μ l置Ep管中, 离心10000rpm×1 min。
2. 弃上清，加ddH 2 O 200μ l, 摇匀20s。
3. 加6mol/L NaI 200μ l, 缓慢倒置摇匀20s。
4. 于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μ l, 缓慢颠倒混匀两相，离心10 000rpm×10min。
5. 吸取上层水相350μ l置一新Ep管中，加纯异丙醇200μ l, 混匀。
6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
Water phase (DNA) Water phase(DNA) proteins
precipitate chloroform
/isoamyl alcohol (lipids) STEP 5
1. 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH 2 O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。
2. 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。
3. 弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。
4. 0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。
5. 室温下放置16h或65℃放置1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶解。
【 注意事项】
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。
DNA测序
基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）
DNA的鉴定 一、 紫外法测 DNA 的纯度及浓度
原理：
组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50μ g/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25μ g/ml的核酸溶液。
操作
取15μ l DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比色并记录。
定量分析：
DNA＝A260×核酸稀释倍数(3000/15)×50/1000
=10×A260(ug/ul) 纯度分析：
DNA
A260/A280=1.8
A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化；
A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤;
A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。
注：
此法不能区分 DNA 和 RNA ，不能用于核酸粗制品的测定。
核酸凝胶电泳
核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的标准方法。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
原理 DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254－365nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
【试剂与材料】
】
1．5×TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。
2．0.5×TBE缓冲液 (pH 8.3) 3．溴化乙锭(EB)：
5 mg/ml 4．1－2% 琼脂糖凝胶: 琼脂糖1－2 g加至100 ml 0.5×TBE缓冲液, 加热熔解备用。
5．6×凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中，4℃保存。
6．DNA分子量标准
【操作步骤】
】
1．琼脂糖凝胶板的制备：将1%－2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到65℃加EB至终浓度0.5μ g/ml，倒入凝胶槽，厚度约3－5mm，放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1－2mm为止。
2．加样：样品中加1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混匀，取15μ l加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。
3．电泳：电压2－10V/cm 胶, 待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。
4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的DNA区带。
【注意事项】
】
1．加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。
2．上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。
3．EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液用后应妥善净化处理。
4．电泳过程中，EB向阴极移动，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 μ g/ml EB溶液中重新染色后检测。
5．加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1－0.5μ g即可有良好的观察效果。
6．小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(＞10 V/cm)。应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。
思考题 1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样缓
冲液中）、电泳中（加在凝胶中）、电泳后
（凝胶浸泡于EB溶液中）的染色过程，各有
何有优缺点？
