材料（Pimiento、HXR-WU-02、猪大肠及Chile Guajillo）5个不同长度区组的花蕾进行染色观察，研究辣椒的花蕾长度与其花粉中小孢子单核靠边期比例之间的相关性。结果表明，不同品种辣椒花蕾长度与小孢子单核靠边期比例之间存在差异性。且当花蕾长为4.0～4.49 mm时，4个供试辣椒品种Pimiento、HXR-WU-02、猪大肠及Chile Guajillo中在单核靠边期的小孢子比例最高，分别为62.15%，68.04%，74.4%，60.23%。依据花蕾长度与小孢子单核靠边期比例的关系确定游离小孢子培养最佳时期所对应的选蕾标准。
关键词：辣椒；小孢子；花蕾长度；发育时期
中图分类号：S641.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.003
Relationgship between Length of Buds and Ratio of Uninucleate Microspore at Periphery in Capsicum annuum L.
HU Mei1， GAO Jie1， GE Ju-fen2， XU Jian1， ZHU Jun-fang1， WANG Na1
（1.College of Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830052，China； 2. Urumqi Institute of Vegetable，Urumqi， Xinjiang 830075 ，China）
Abstract： In order to improve the accuracy of drawing materials when chili pepper isolated microspore culture，using DAPI fluorescent staining to stain and observe four different varieties of chili pepper （Pimiento， HXR-WU-02， pig intestine and Chile Guajillo） and the five different length interval of chili pepper′s bud， the relationship between length of chili pepper′s bud and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper was studied. The results showed that differences existed between length of bud in different varieties of chili pepper and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper .When the bud length is in 4.0～4.49 mm， the proportion of Uninucleate microspore at periphery of four varieties tested is the highest， and the ration is 62.15%， 68.04%， 74.4% and 62.15%， respectively. So the relationship between length of chili pepper′s bud and ratio of uninucleate microspore at periphery in chili pepper can define the standard of bud selection in correspondence with the optimal stage of anther culture.
Key words： Capsicum annuum L.； microspore； development stage； flower bubs
辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒属一年生或多年生草本植物，原产地在美洲中部和南部的热带地区，在明末传入我国，并被普遍种植，是人们广为熟知的一种蔬菜，也是中国栽培面积最大的蔬菜作物之一[1-3]。辣椒属常异花授粉植物[2]。由于杂种优势十分明显，杂交种一般比常规品种增加30%到50%的产量，同时抗病性、抗逆性提高和适应性增强[4]。因此，研究单倍体育种的工作具有重要意义。
花培和小孢子游离培养是诱导单倍体植株[5]的重要方法之一。国内辣椒花药的培养始于1973年[6]。此后，许多学者对辣椒进行了大量的花药培养试验研究[7-8]，而今已成为获取辣椒单倍体比较成熟的技术，在辣椒遗传育种的工作中已被利用[9-10]。与花药培养相比，游离小孢子培养可获得纯合单倍体植株，可避免花药培养中母体组织带来的杂合体[11]。因此，辣椒小孢子的发育在单倍体的诱导、遗传物质的建立、品种的选育和栽培方法的制定方面具有重要的意义[12]。目前有关报道辣椒游离小孢子培养获得植株成功的较少[13]，主要是因为技术体系的建立不完善，还不能应用于遗传育种或基础性研究[1]。但是，有研究表明花蕾的选取标准是游离小孢子培养的重要技术之一[14-15]，而花蕾取材时期的选择又是影响胚胎发生效率的主要因素之一[16]，以往的辣椒游离小孢子培养试验研究表明单核末期是最佳时间[17]。目前，在新疆还没有辣椒小孢子培养研究的相关报道。本试验对新疆及国外引进的辣椒品种花粉细胞的发育进行细胞学观察，探讨不同辣椒品种蕾长和其小孢子单核靠边期比例之间的相关性，以期为辣椒游离小孢子培养选取花蕾提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
供试辣椒品种有Pimiento、Chile Guajillo、HXR-WU-02及新疆农家品种猪大肠。Pimiento，品种类型为樱桃椒，来源墨西哥；Chile Guajillo，品种类型为线椒，来源墨西哥；HXR-WU-02，品种类型为线椒，来源荷兰；猪大肠，品种类型为长角椒，来源天地和种业（新疆）。
1.2 方 法
1.2.1 植株培养 2014年5月1日，在新疆农业大学综合实验楼组培实验室对辣椒种子进行温汤浸种，然后催芽。5月5日在新疆农业大学实验基地的简易大棚内将辣椒播种于穴盘，6月11日定植移栽在新疆农业大学实验基地，其后采取正常的田间管理。
1.2.2 不同长度区组的花蕾对应花粉细胞发育时期的观察 植株初花期，在上午8：00到10：00时摘取不同长度的花蕾45～60个纳入自封袋，放入冰盒带回实验室。然后使用游标卡尺量取花蕾长度，按花蕾不同长度分为5组，分别是2.00～2.99 mm、3.00～3.99 mm、4.00～4.49 mm、4.50～4.99 mm、5.0～5.99 mm。每一组分别选择10～20个花蕾，先用2%的NaClO冲洗10 min，再用无菌水清洗3～4次。而后旋转注射器活塞（必须用没有黑色橡胶的一端）压榨花蕾使其完全破碎，添加2 mL NLN培养基提取花粉小孢子，在冷冻离心机离心3次（150 s），转速为6 000 r·min-1。将上清液倒掉，留下沉淀物。再用移液枪吸10 μL的DAPI染色液加入到沉淀里，放置黑暗处15 min后制备切片，而后将切片置于冰箱且在4 ℃条件下保存，且第2天将切片放置在荧光显微镜下观察。
1.3 数据整理和分析
使用2003 Excel表格整理试验数据，并使用DPS数据处理系统对试验数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 辣椒花粉小孢子各发育时期的细胞学特征
荧光显微镜镜检观察结果表明（如图1），此4份辣椒品种Pimiento、HXR-WU-02、猪大肠及Chile Guajillo的花蕾长在2.00～2.99 mm时，花蕾中多数的花粉小孢子在单核早、中期，而少数的在四分体时期。四分体时期是花粉母细胞经由减数分裂产生的被一层厚的胼胝质包围并呈对称形排列在同一平面的四分小孢子，即四分体。单核早、中期的花粉小孢子体积变大，形成明显的细胞壁，居于小孢子的中心含有一个较大的细胞核，细胞质中无显著可见的液泡。花蕾长为3.00～3.99 mm、4.00～4.49 mm时，花粉细胞内出现液泡，核从中心被挤压到靠近细胞壁的边缘，即单核晚期，萌发孔显现。花蕾长度在4.50～4.99 mm、5.00～5.99 mm时，单核靠边期的花粉细胞体积持续增加，细胞呈正圆形，通过有丝分裂产生生殖核和营养核，此时为双核期，前者较大且染色较深，后者较少且染色较浅。因此，通过对不同长度区组的花蕾中花粉小孢子发育各时期的细胞学特征的观察和了解，且在不对花蕾进行染色试验的情况下，可快速地判别出花蕾中花粉小孢子所处的发育阶段。花粉小孢子的形态变为正圆状，细胞核被挤压靠近细胞壁和显现萌发孔是小孢子单核靠边期的主要识别特征。
2.2 不同品种辣椒花蕾的不同长度区组与单核靠边期小孢子比例的关系
从表1可知，不同辣椒品种不同蕾长的单核靠边期花粉小孢子比例有着显著性差异。Pimiento、HXR-WU-02、猪大肠及Chile Guajillo此4个辣椒品种的花蕾长度在4.00～4.49 mm时与其它4个长度区组之间差异显著，在该长度范围内，4个辣椒品种的单核靠边期的小孢子所占比例分别为62.15%，68.04%，74.4%及60.23%。HXR-WU-02该辣椒品种的花蕾长度在3.00～3.99 mm与4.50～4.99 mm和3.00～3.99与5.00～5.99 mm时，花蕾中单核靠边期小孢子比例的差异性不显著，且所对应的花粉小孢子的单核靠边期比例在40%到10%之间。Chile Guajillo的花蕾长度在4.50～4.99与3.00～3.99 mm时没有显著的差异，而对应的花粉小孢子在单核靠边期的比例皆在30%左右。而当花蕾长在2.00～2.99 mm时，此4个辣椒品种的比例皆为0。因此，可把蕾长作为后续的辣椒小孢子培养试验研究中的采样指标。
3 结论与讨论
（1）经对花蕾进行DAPI染色后和在荧光显微镜下观察发现：花粉小孢子的发育在同一长度区组的花蕾中是连续性的即不同步。辣椒花蕾长在2.00～2.99 mm、3.00～3.99 mm时，主要是单核早、中期花粉小孢子。但蕾长在2.00～2.99 mm时少数的小孢子处于四分体时期，而在3.00～3.99 mm时少量的花粉小孢子处于单核靠边期。花蕾长为4.00～4.49 mm时，处在单核晚期小孢子的比例超过60%，另外此时也尚有双核花粉小孢子存在。当蕾长在4.50～5.99 mm时双核花粉小孢子占绝大多数，单核晚期小孢子出现较少。
（2）本试验采用的DAPI染色法相较于张祖姣等[12]和杨智博等[18]的石蜡切片法、张菊平等[16]和张天翔等[19]的醋酸洋红染色法或PHCH染色法而言，具有操作简单、省时省力、易于观察等优点。以往的研究发现：小孢子的发育阶段与辣椒花蕾的外部形态密切相关[18-20]。但是，本试验主要观察不同品种类型和长度的辣椒花蕾中花粉小孢子发育时期的细胞学特性，研究辣椒花蕾长度与其花粉细胞单核靠边期所占比例之间存在的关系。
（3）辣椒蕾长与其单核晚期花粉小孢子比例之间的关系，可以视为小孢子是否适合诱导单倍体培养的指标。若按照辣椒花蕾的长度取材并应用于后期的游离小孢子培养研究中会很方便、快捷，且降低污染。本次试验的结果是，4个供试辣椒品种Pimiento、HXR-WU-02、猪大肠及Chile Guajillo的蕾长为4.00～4.49 mm且花蕾发育正常，其小孢子的单核靠边期比例分别为62.15%，68.04%，74.4%及60.23%。
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