对照。取材样品以液氮速冻后置于-70 ℃冰箱保存。
1.2 方法与步骤
1.2.1 总RNA的提取
采用北京天根TIANGEN RNA plant plus reagent作为总RNA提取试剂，方法参照试剂盒小量法提取步骤稍做改动，0.1 g植物材料液氮研磨，转至1 mL提取试剂中振荡混匀，室温放置5 min，4 ℃ 12 000 r/min离心1 min，转移上清，加0.1 mL 5 mol/L NaCl、加0.3 mL氯仿，颠倒混匀，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，转移上层水相，加等体积异丙醇，混匀，放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，75%乙醇漂洗沉淀，弃上清，室温晾干沉淀，加适量DEPCddH2O溶解混匀，-70 ℃保存。
1.2.2 RTPCR扩增
反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas （MBI），取5 μg植物总RNA、1 μL随机六聚体引物（0.2 μg/μL），加适量DEPCddH2O至12 μL，70 ℃变性5 min，冰浴冷却，依次加入4 μL reaction buffer、1 μL ribonuclease inhibitor（20 U/μL）、2 μL dNTP（10 mmol/L），25 ℃温育5 min，加入1 μL MMuLV reverse transcriptase，42 ℃温育1 h，70 ℃ 10 min灭活反转录酶。反应完毕后，产物冰上冷却，-20 ℃保存备用。反转录产物适量稀释后用于PCR扩增。
选取李属坏死环斑病毒（PNRSV）、李矮缩病毒（PDV）、樱桃病毒A（CVA）、樱桃绿环斑驳病毒（CGRMV）、樱桃小果病毒2（LChV2）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、樱桃锉叶病毒（Cherry rasp leaf virus，CRLV）、樱桃叶斑驳病毒（CMLV）、樱桃小果病毒1（Little cherry virus1，LChV1）及樱桃坏死锈斑驳病毒（CNRMV）作为检测对象，根据GenBank上公布的上述病毒基因组序列为参照，设计合成的引物序列如表1。
选取相应引物用于各病毒的检测，反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 PCR产物克隆测序
PCR产物连接至pMD 18T vector（TaKaRa），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性菌落，提取质粒，酶切鉴定后样品送Invetrogen公司测序，序列分析采用DNAMAN软件。
2 结果与分析
2.1 甜樱桃花叶病症状
以山东省泰安市肥城边院镇甜樱桃生产示范园作为田间症状观察地点，对果园内甜樱桃品种‘红灯’花叶病症状进行观察记录。据观察，植株从3月底至4月初尚未完全展叶时即可发病，至5月底-6月上旬症状表现达到高峰。花叶型叶片无萎蔫腐烂现象，病斑表面未见霜状或粉状霉层，表面无菌脓或黄色晕圈。在早春尚未完全展叶时叶片上可见黄绿相间的花叶斑驳病斑，随着叶片展开，病斑出现褪绿黄化现象，伴随有叶片皱缩、凸起及缺刻症状。有的叶片次脉周围出现淡黄绿色至浅绿色的带纹、环斑和褪绿斑，后期环斑内部组织坏死脱落，出现穿孔。感病植株整体生长迟缓，花朵小而少，结果量少，果实偏小，落花落果现象严重（图1）。冬季叶片花叶症状出现隐症现象，保护地栽培中发病较重。
2.2 RTPCR鉴定
提取叶片总RNA，以随机六聚体引物反转录的cDNA第一链为模板，选取各病毒的特异性检测引物进行RTPCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示（图2），10种甜樱桃待检病毒中，5种病毒检测结果呈阳性，分别为PNRSV、PDV、CVA、CGRMV、LChV2；3种不同的砧木样品中都有病毒检出，花叶型样品均至少同时感染2种病毒，多病毒复合感染比例较高，病毒组合与叶片症状表型无明显对应关系。例如，1、2号为以G5为砧木的褪绿斑驳型甜樱桃样品，7～12号为以G7为砧木的黄绿相间带纹花叶型甜樱桃样品，却同时感染PNRSV、PDV、CVA、CGRMV、LChV2 5种病毒；3～6号同为DQY砧木的样品，植株叶片都出现坏死环斑症状类型，但感染病毒组合类型却不尽相同。然而，不同砧木类型，不同花叶症状类型的叶片均同时感染CGRMV和LChV2。花叶病甜樱桃样品中，嫁接砧木差异与其病毒感染情况并无规律性可循，说明病毒危害与砧木类型无明显相关性。各病毒的检出率都在83.3%以上，说明花叶病危害植株体内普遍存在病毒感染（表2）。为进一步验证该检测的准确性，将各病毒检测的PCR片段连接至克隆载体pMD18T vector，克隆测序，序列结果与GenBank中各病毒基因组序列相应区段比对，同源性皆在91%～99.27%之间。以上结果表明，皱叶型甜樱桃树体至少感染5种病毒，而病毒组合类型与叶片症状、砧木类型无明显对应关系。
3 讨论
植物花叶病与多因素相关，但各因素产生的花叶病症状却不尽相同。本试验根据各因素产生的症状差异排除叶片感染真菌和细菌的可能[38]。据观察，田间叶片皱缩，多黄绿相间的斑驳花斑，严重的出现线纹、带纹或褪绿环斑，与文献记录的病毒病症状相似[9]。
试验选取文献报道较多、与花叶相关的10种甜樱桃病毒为鉴定对象，以嫁接3种不同砧木类型的花叶型‘红灯’样品为材料进行RTPCR鉴定。结果显示，感病样品5种甜樱桃病毒检测呈阳性，且多为病毒复合侵染。进一步分析发现，不同病毒侵染组合与花叶病的不同症状类型、不同砧木类型并无直接相关性。检出结果显示，PNRSV、PDV、CVA检出率均较高。据报道PNRSV可导致大樱桃坏死环斑病和皱缩花叶病，叶片皱缩，出现坏死环斑，后期病斑内部脱落形成穿孔，严重时植株整株枯死，造成绝产[10]；PDV可引起大樱桃褪绿环斑病和叶片黄化病，植株产生淡绿色斑点或黄绿相间斑驳，叶脉透明，叶略有皱缩[11]；CVA为我国近来发现的一种侵染樱桃的潜隐性病毒，危害症状不明显[16]，但CVA经常和樱桃小果病毒等其他病毒复合侵染，使果实产量和品质明显下降[17]，以上症状描述均与观察结果相符。另外，各样品均同时感染CGRMV及LChV2。关于CGRMV对植物的危害尚无明确结论[18]。而LChV2是樱桃小果病的致病原之一，可导致果实发育不完全、糖度降低、上色不均匀等，严重影响甜樱桃的经济性状[1920]。具有花叶病症状的甜樱桃植株通常果实败育或坐果率不高，推测与感染LChV2有关。
本研究结合症状观察与分子生物学检测方法，首次对山东泰安地区嫁接在3种不同砧木上的甜樱桃品种‘红灯’花叶病病样病毒感染情况进行了调查，对当地花叶病树体的症状进行记录，初步探明泰安地区甜樱桃“花叶病”树体内确有病毒存在。花叶病植株体内有多种病毒存在，树体花叶类型不同可能与体内不同病毒种类的复合侵染相关，病毒复合侵染加重了对甜樱桃植株的危害。但关于以上病毒单独或复合侵染甜樱桃是否会引起花叶病，还需要通过试验证实。接下来我们会进一步进行病毒回接试验，根据科赫氏法则，结合病毒在草本指示植物及木本指示植物上的症状表现，做出最终的判定，为花叶病的分子生物学鉴定及综合防治提供可靠的科学依据。由于目前病毒病传播快，危害严重，而无有效的药物防治，因此，对果园实行检疫、对病株及时隔离和疏除、嫁接接穗选用无毒材料是当前最有效防治措施。而花叶型叶片可能作为甜樱桃感染病毒病的指示性症状，为今后病害类型的快速诊断奠定基础。
参考文献
[1] 张福兴，孙庆田，张序，等. 我国大樱桃产业现状与发展对策[J]. 烟台果树，2012，119（3）：35.
[2] 吴雅琴，程和禾，常瑞丰，等. 甜樱桃病毒病的发生及防治[J]. 河北农业科学，2010，14（10）：4445，47.
[3] 晋图强，王金玉，陈红艳，等. 果树缺素症的症状及防治对策[J]. 现代农业科技，2012（14）：91.
[4] 鄢新民，葛元华，刘建库，等. 果树缺素症状及防治[J]. 现代农村科技，2012（1）：2627.
[5] 周世玉.林果树缺素症的识别与防治[J].价值工程，2010，29（15）：163.
[6] 刘保友，张伟，栾炳辉，等. 大樱桃褐斑病病原菌鉴定与田间流行动态研究[J]. 果树学报，2012，29（4）：634637.
[7] 李寿义. 大樱桃主要病虫害发生规律与无公害防治技术[J]. 河北果树，2012（1）：2224.
[8] 史贺奎，杜相堂，张承胤，等. 樱桃细菌性病害发生特点及防治技术[J]. 山西果树，2013（1）：2728.
[9] 董薇，宋雅坤，吴明勤，等. 大樱桃病毒病研究进展[J]. 中国农学通报，2005，21（5）：332336.
[10]侯义龙，张开春，杨俊玲.应用RTPCR方法检测桃和樱桃及其组培苗上的PNRSV和PDV[J].果树学报，2005，22（3）：292293.
[11]侯义龙，杨俊玲，李春敏.李矮缩病毒RTPCR方法建立及检测应用[J].中国农业科学，2005，38（2）：425427.
[12]Zhou Jufang，Wang Guoping，Kuang Rongfang，et a1.First report of Cherry green ring mottle virus on cherry and peach grown in China [J].Plant Disease，2011，95（10）：1319.
[13]凌薇，马云霞，朱水芳，等. 利用实时荧光定量PCR技术检测樱桃叶斑驳病毒[J]. 植物检疫，2011，25（2）：2831.
[14]Masamichi Isogai， Jun Aoyagi， Megumi Nakagawa， et al. Molecular detection of five cherry viruses from sweet cherry trees in Japan[J]. Journal of General Plant Pathology， 2004， 70（5）：288291.
[15]许志刚. 面向21世纪课程教材，普通植物病理学[M]. 第3版.北京：中国农业出版社，2003.
[16]Marais A， Candresse T， SvanellaDumas L， et al. Cherry virus A [M]∥Hadidi A， Barba M， Candresse T， eds. Virus and viruslike diseases of pome and stone fruits. St Paul， MN， USA： APS Press， 2011.
[17]Marais A， SvanellaDumas L， Barone M， et al. Development of a polyvalent RTPCR detection assay covering the genetic diversity of cherry capillovirus A[J]. Plant Pathology， 2012， 61： 195204.
[18]Zhang Y P， Kirkpatrick B C， Smart C D， et al. cDNA cloning and molecular characterization of Cherry green ring mottle virus [J]. Journal of General Virology， 1998， 79： 22752281.
[19]Eastwell K C， Bernardy M G. Partial characterization of a closterovirus associated with apple mealybugtransmitted little cherry disease in North America [J]. Phytopathology， 2001， 91（3）： 268273.
[20]Rott M E，Jelkmann W. Detection and partial characterization of a second closterovirus associated with little cherry disease， little cherry virus2 [J].Phytopathology，2001，91（3）：261267.
