[摘要] 目的 药效学结合有效成分含量优选肠安Ⅰ号方的提取工艺，并探究复方中有效成分含量与药效学指标间的相关性。 方法 通过小鼠止泻及镇痛试验确定最佳提取工艺路线，并通过SPSS 17.0软件对肠安Ⅰ号方治疗肠易激综合征的有效成分与药效学指标进行Pearson相关系数分析。 结果 肠安Ⅰ号方最佳提取工艺路线为全方水提，其有效成分芍药苷含量与镇痛率呈正相关（P < 0.01），与腹泻指数无明显相关性（P > 0.05）。 结论 采用量效融合法评价优选最佳提取工艺是科学合理的，为中药提取工艺的优化提供了一种新的思路，同时也为肠安Ⅰ号方的临床应用提供了可靠的实验依据。
[关键词] 肠安Ⅰ号方；肠易激综合征；提取工艺；量效
[中图分类号] R574.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（a）-0021-04
Optimized extraction technology of Chang′an No.Ⅰ based on dose-effect fusion evaluation method
LIU Yu1 ZHENG Rui1 WANG Fengyun2 TANG Xudong2 MA Xiangxue2 SHI Xiaoshuang2 SUN Qiaohong1 JIN Jing1
1.Manufacturing Laboratory of Chinese Medicine， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China； 2.Department of Spleen and Stomach Diseases， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China
[Abstract] Objective To optimize the extraction technology of Chang′an No.Ⅰ by pharmacodynamics combined with active ingredient contents， and to explore the correlation between active ingredient contents and pharmacodynamics indicators. Methods The antidiarrheal and analgesic tests were used to optimize the best extraction process. SPSS 17.0 software was used to analyze the Pearson correlation between the active ingredients of Chang′an No.Ⅰ in the treatment of irritable bowel syndrome and pharmacodynamics indicators. Results The best optimal extraction process of Chang′an No.Ⅰ was water extract. There was a positive correlation between paeoniflorin content and analgesic rate （P < 0.01）， and there was no significant correlation between paeoniflorin content and diarrhea index （P > 0.05）. Conclusion It is scientific and reasonable to evaluate and optimize the extraction process by dose-effect fusion method. It provides a new way to optimize the extraction process of Chinese medicine， and also provides a reliable experimental basis for the clinical application of Chang′an No.Ⅰ.
[Key words] Chang′an No.Ⅰ； Irritable bowel syndrome； Extraction process； Dose-effect
腸易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种常见的功能性肠病，其症状复杂多样，易反复发作，严重影响患者的生活质量[1]。肠安Ⅰ号方是唐旭东教授在经典名方痛泻要方的基础上结合20余年临床经验优选出的中药复方，遵循中医对腹泻型IBS的疏肝健脾、温中固涩的治则及立法，按照方药的君、臣、佐、使组方，该方由炒白芍、炒白术、防风、姜炭等药味组成，具有疏肝健脾、温中散寒止泻之效[2]。优化该方的研究从1999年开始，有研究提示该方可降低实验大鼠的内脏高敏感性[3-4]，改善患者的腹痛腹胀症状，临床疗效显著[5-6]。
为提高临床使用的便捷性，本研究对肠安Ⅰ号方进行了工艺研究。通过药效学试验结果和指标成分的含量测定结果初选了肠安Ⅰ号方的提取工艺路线[7]，并将有效组分含量与药效学指标进行了相关性分析[8-10]，为临床治疗IBS新药的研发提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Angilent 1100高效液相色谱仪（美国Angilent公司，DAD检测器）；Agilent Z0RBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ME4002E型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，1/10万]；BRANSON 8510E（美国Branson超声波有限公司）；数显恒温水浴锅HH-6（国华电器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵[邦西仪器科技（上海）有限公司]；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏设备有限公司）。
1.2 试药
芍药苷对照品（纯度95.2%，批号：110736-201640），购自中国食品药品检定研究院。
处方中炒白芍、炒白术、防风、姜炭等饮片均购自河北百草康神药业有限公司，经鉴定均符合2015年版《中国药典》饮片標准，含量测定结果均合格。
乙腈（色谱纯，Fisher公司）；磷酸（分析纯，北京北化精细化学品有限责任公司）；屈臣氏饮用水（蒸馏法制，广州屈臣氏食品饮料有限公司）。
1.3 实验动物
SPF级小鼠200只，雌雄各半，6周龄，体重18～22 g，斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）20146-0002。饲养环境：温度22～26℃，相对湿度40%～70%。
2 方法与结果
2.1 肠安Ⅰ号方不同提取物的制备
提取物Ⅰ（水提）：按处方比例称取饮片，加水提取2次，第1次加8倍量水提取1.5 h，第2次加6倍量水提取1.0 h，合并提取液，浓缩至相对密度1.3（70℃），60℃减压干燥，即得。
提取物Ⅱ（水提醇沉）：按处方比例称取饮片，加水提取2次，第1次加8倍量水提取1.5 h，第2次加6倍量水提取1.0 h，合并提取液，浓缩至含生药1 g/mL；加95%乙醇至乙醇体积分数达50%，滤过，上清液回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度1.3（70℃），60℃减压干燥，即得。
提取物Ⅲ（炒白芍等水提，防风等提油）：炒白芍等7味药按照工艺Ⅰ水提，防风、柴胡加6倍量水提取挥发油10 h，收集挥发油备用，提取液与水提液合并，浓缩至相对密度1.3（70℃），60℃减压干燥，即得。
提取物Ⅳ（炒白芍等水提醇沉，防风等提油）：炒白芍等7味药按照工艺Ⅱ水提醇沉，防风、柴胡加6倍量水提取挥发油10 h，收集挥发油备用，提取液与回收乙醇的水提醇沉液合并，浓缩至相对密度1.3（70℃），60℃减压干燥，即得。
提取物Ⅴ（炒白芍等水提，防风等醇提）：炒白芍等7味药按照工艺Ⅰ水提，防风、柴胡加6倍量60%乙醇提取2次，每次1.0 h，滤过，上清液回收乙醇至无醇味，与水提部分浓缩液合并，60℃减压干燥，即得。
提取物Ⅵ（炒白芍等水提醇沉，防风等醇提）：炒白芍等7味药按照工艺Ⅱ水提醇沉，防风、柴胡加6倍量60%乙醇提取2次，每次1.0 h，滤过，上清液回收乙醇至无醇味，与水提醇沉部分无醇浓缩液合并，60℃减压干燥，即得。
2.2 芍药苷含量测定
2.2.1 色谱条件 Agilent Z0RBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（12∶88）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温30℃，进样量10 μL[11]。见图1。
2.2.2 芍药苷含量测定结果 提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ生药量质量分数分别为4.11、6.31、4.33、5.64、4.50、6.96 mg/g，出膏率依次为24.35%、15.85%、23.08%、17.72%、22.24%、14.37%。芍药苷占提取物和生药的质量分数及其转移率结果见表1。
2.3 止泻试验
2.3.1 分组与给药 小鼠90只，雌雄各半，分别双色标记编号，采用随机数字表法将其分为九组，分别为空白对照组，空白模型组，阳性对照组，肠安Ⅰ号提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组，每组10只，雌雄各5只。空白对照组和空白模型组灌胃给予20 mL/kg纯化水，阳性对照组灌胃马来酸曲美布汀0.078 g/kg，肠安Ⅰ号提取物各组日给药剂量均为15.470 g/kg（按生药量计）。各组小鼠灌胃7 d，除空白对照组外，各组均于末次灌胃后1 h给予蓖麻油20 mL/kg，并将每只小鼠单独置于清洁的代谢笼，笼底垫干净滤纸，计数1 h内干粪数和湿粪数，计算稀便率，稀便率=稀便数/总便数×100%；稀便级以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小定级，分为4级：1级为污染直径<1 cm，2级为污染直径1～<2 cm，3级为污染直径2～<3 cm，4级为污染直径≥3 cm。平均稀便级=每只动物的所有稀便级之和/稀便数。腹泻指数=稀便率×平均稀便级。根据稀便率和平均稀便级计算出腹泻指数[12-13]。
2.3.2 对蓖麻油所致小鼠腹泻的影响 如表2所示，与空白对照组比较，空白模型组小鼠在蓖麻油的作用下，腹泻指数显著增加（P < 0.01）。与空白模型组比较，肠安Ⅰ号提取物Ⅰ组在蓖麻油作用0～1 h、1～2 h、2～3 h均呈显著的腹泻抑制作用（P < 0.05或P < 0.01），可以显著降低蓖麻油作用4 h内的腹泻指数（P < 0.01），其止泻作用与马来酸曲美布汀相当。
2.3.3 相关性分析 通过SPSS 17.0软件将六组提取物中芍药苷的含量分别与不同时间段的腹泻指数进行Pearson相关系数分析，芍药苷含量与0～1 h、1～2 h、2～3 h、3～4 h时间段腹泻指数的相关系数r分别为-0.605、-0.290、-0.312、-0.151。结果提示，不同时间段芍药苷含量与小鼠腹泻指数无明显相关性，差异均无统计学意义（P > 0.05）。
2.4 镇痛试验
2.4.1 分组与给药 小鼠80只，雌雄各半，分别双色标记编号，采用随机数字表法将其分为八组，分别为空白模型组，阳性对照组，肠安Ⅰ号提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组，每组10只，雌雄各5只。空白模型组灌胃给予20 mL/kg纯化水，阳性对照组灌胃阿司匹林0.026 g/kg，肠安Ⅰ号提取物各组日给药剂量均为15.470 g/kg（按生药量计）。各组小鼠灌胃5 d。第5天灌胃后，各组小鼠均于末次给药后20 min，按照10 mL/kg，腹腔注射0.6%冰醋酸（冰醋酸溶液临用前配制）。冰醋酸注射后，将小鼠置于清洁的小鼠饲养箱中，小鼠将有躯干伸张、腹部内凹、臀部抬高等扭体表现，观察20 min内小鼠发生扭体反应（扭体反应的标准：伸展后肢、躯体扭曲、腹部内凹和臀抬高）次数，并记录每只小鼠发生初次扭体的时间，计算扭体发生率和镇痛率[14-16]。扭体发生率=该组发生扭体反应的鼠数/该组鼠数；镇痛率=（对照组扭体次数-给药组扭体次数）/对照组扭体次数。
2.4.2 对化学刺激所引起疼痛的镇痛作用 如表3所示，与空白模型组比较，肠安Ⅰ号提取物Ⅰ组及阳性对照组的初次扭体时间均明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；而肠安Ⅰ号提取物Ⅰ组与阳性对照组的初次扭体时间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。与空白模型组比较，肠安Ⅰ号提取物Ⅰ、Ⅲ组和阳性对照组的扭体次数均明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。肠安Ⅰ号提取物Ⅰ组镇痛率较高。
2.4.3 相关性分析 采用SPSS 17.0软件将六组提取物中芍药苷的含量与镇痛率进行Pearson相关系数分析，结果提示，芍药苷含量与小鼠镇痛率呈正相关（r = 0.940，P < 0.01）。
3 讨论
肠安Ⅰ号方以炒白芍、炒白术、姜炭等为主要药味，具有疏肝健脾、温中散寒止泻之效，用于治疗腹泻型IBS。因中药复方组成复杂，药效作用物质基础不明确，本研究以小鼠止泻试验和镇痛试验对工艺路线进行初步考察，使優选的工艺更加科学、合理[17-18]，且与临床应用剂型相吻合。
方中炒白芍柔肝缓急止痛，针对腹泻腹痛而设为君药，且白芍炒用性缓，柔肝，和脾，止泻[19]。将芍药苷含量与镇痛率进行相关性分析，进一步提示其具有镇痛之功效。据文献报道，白芍经炒制后芍药苷含量有所下降，而芍药内酯苷及苯甲酰芍药苷含量均有所升高[20]，推断芍药苷并非止泻的关键或唯一成分。肠安Ⅰ号方中发挥直接止泻作用的有效成分有待进一步挖掘。
[参考文献]
[1] 曾之晅，杨欢，杨新，等.肠易激综合征治疗研究进展[J].中华内科杂志，2017，56（2）：140-143.
[2] 苏敏，王凤云，唐旭东.唐旭东教授应用肠安Ⅰ号方治疗腹泻型肠易激综合征的临床经验[J].中华中医药杂志，2015，30（3）：764-766.
[3] 赵迎盼，苏敏，王凤云，等.肠安Ⅰ号方对肠易激综合征内脏高敏感大鼠5-HT信号系统及海马BDNF mRNA表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2015，35（10）：1228-1235.
[4] 王微，张北华，王凤云，等.肠安合剂对腹泻型肠易激综合征大鼠血清中5-羟色胺表达的影响[J].中华中医药杂志，2015，30（11）：3905-3909.
[5] 唐旭东，王凤云，陆芳，等.肠安Ⅰ号方治疗腹泻型肠易激综合征的多中心、随机、双盲、安慰剂对照临床研究[C]//中华中医药学会2013年学术年会论文集，2013：326-339.
[6] 卞立群，陆芳，李振华，等.IBS-SSS、AR及IBS-QOL在IBS临床疗效评价中的反应度分析[J].中国中西医结合杂志，2016，36（10）：1191-1196.
[7] 张雷，刘竞天.基于指标成分和药效学优选定痛宁颗粒的醇沉工艺[J].中国药师，2017，20（11）：1979-1982.
[8] 黎丹，李三华，杨龙江，等.基于组效关系的石上柏挥发油抗肿瘤有效成分的辨识[J].中国实验方剂学杂志，2018， 24（2）：44-50.
[9] 邹薇，张鹤，包永睿，等.延胡索提取工艺的优化及化学成分与药效指标相关性分析[J].中草药，2012，43（4）：694-698.
[10] 郑莹，王帅，孟宪生，等.基于量效融合评价的正交优选核桃楸皮抗肝SMMC-7721肿瘤黄酮类成分的提取工艺[J].中药材，2013，36（10）：1686-1689.
[11] 张顺平，张顺吉.HPLC法测定肠炎安康胶囊中芍药苷含量[J].中国民族民间医药，2017，26（7）：21-23.
[12] 陈艳芬，梁万年，江涛，等.肠乐胶囊治疗腹泻型肠易激综合征的药效学研究[J].中成药，2016，38（3）：499-504.
[13] 王海荣，朱振娜，付合明，等.肠炎宁颗粒对幼龄小鼠的抗炎止泻作用及体外抗菌作用研究[J].药物评价研究，2017，40（12）：1701-1705.
[14] 王慧超，张威，李铁军，等.不同炮制法白芍制品的含量检测对比及其镇痛效果研究[J].陕西中医，2018，39（5）：672-674.
[15] 刘延欣，魏会勤.白芍不同炮制品芍药苷含量测定及其镇痛作用的比较研究[J].世界最新医学信息文摘，2018， 18（2）：88.
[16] 施锁平，钱丽华，岳豪祥，等.白芍不同炮制品芍药苷含量测定及其镇痛作用的比较研究[J].中国中医药科技，2016，23（3）：286-288.
[17] 冀虎圣，俞发.痛泻要方的抗炎镇痛止泻作用及对PGE2/cAMP信号通路的影响[J].时珍国医国药，2010，21（3）：775-776.
[18] 宋宁，王宪龄，杨丰滇.加味痛泻要方镇痛止泻的实验研究[J].中药药理与临床，2011，27（4）：85-87.
[19] 邱承权.不同炮制方法对白芍质量的影响研究[J].中国社区医师，2018，34（1）：15，17.
[20] 赵园园，梁德勤，金传山，等.基于HPLC指纹图谱的亳白芍不同炮制品标准汤剂7个成分含量测定[J].天然产物研究与开发，2018，30（3）：404-411，500.
（收稿日期：2018-05-07 本文编辑：张瑜杰）
