对照。观察肝癌组织、癌旁组织中的miR-375表达水平并进行比较。结果 77例肝癌患者的癌组织中miR-375相对表达水平低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）;不同性别、年龄、肝功能Child-pugh分级、体力状况（ECOG）评分、病灶数量、巴塞罗那（BCLC）分期肝癌组织中的miR-375相对表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。肿瘤直径≥5 cm肝癌组织中的miR-375相对表达水平低于肿瘤直径<5 cm，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-375相对表达水平与患者的肿瘤直径成负相关（r=-4.521，P<0.05）。结论 肝癌患者组织中miR-375的表达水平同肿瘤直径存在密切关系。
[关键词]肝癌;组织;miR-375;表达水平
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）12（c）-0029-04
Expression analysis of non-coding microRNA-375 in tissues of patients with liver cancer
ZHANG Ping
Department of Pathology， the Ninth Hospital of Nanchang City， Jiangxi Province， Nanchang 330002， China
[Abstract] Objective To study the expression of non-coding microRNA-375 （miR-375） in tissues of patients with liver cancer. Methods Seventy-seven patients with liver cancer who underwent surgical resection in our hospital from July 2014 to December 2018 were selected as subjects in this study. The non-coding microRNAs （miRNAs） from these cancer patients were extracted. The normal tissues near to cancer ones were selected as control. The expression levels of miR-375 in liver cancer tissues and normal tissues were observed and compared. Results The relative expression level of miR-375 in the cancer tissues of 77 patients with liver cancer was lower than that in the normal tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. The relative expression levels of miR-375 in liver cancer tissues of different genders， age， Child-pugh liver function grading， physical status （ECOG） scores， number of lesions， and Barcelona （BCLC） stage were compared， and the differences were not statistically significant （P>0.05）. The relative expression level of miR-375 in liver cancer tissues with tumor diameter ≥5 cm was lower than that of tumor diameter <5 cm， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The relative expression level of miR-375 was negatively correlated with tumor diameter （r=-4.521， P<0.05）. Conclusion The expression level of miR-375 in liver cancer patients is closely related to tumor diameter.
[Key words] Liver cancer; Tissue; miR-375; Expression level
肝癌是恶性肿瘤中发病率较高的一种[1]，且具有较高的恶性程度，病情发展快且治疗难度大，会对患者的生命安全构成极大的威胁。非编码微核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一类内源性非编码单链小分子RNA[2]，其在多种生理、病理过程中，如细胞发育、增殖、分化等，均发挥着显著作用。miRNA具有癌基因、抑癌基因的作用（可扮演癌基因和抑癌基因的角色），其参与了肿瘤的发生及发展[3]。在肝癌患者的肝细胞、外周血清中，有多种miRNA表达的改變存在，异常表达miRNA的发现为临床丰富对肝癌发病机制的认识、探索新的基因靶向治疗方案提供了指导[3]。另外miRNA表达同肝癌的病理类型、恶性程度、分期、分级等病理过程存在密切关系，但不同的miRNA类型在肝癌中所发挥的作用存在差异，本研究选取在我院进行手术切除治疗的77例肝癌患者作为研究对象，旨在分析肝癌组织中非编码微核糖核酸-375（miR-375）的表达情况，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2014年7月～2018年12月在我院进行手术切除治疗的77例肝癌患者作为研究对象，提取患者癌组织标本中的miRNAs进行考察，以癌旁正常组织作为对照。77例肝癌患者中，男73例，女4例;年龄26～70岁，平均（43.34±2.86）岁;肝功能Child-Pugh分级：A级62例，B级15例;体力状况（ECOG）评分：0分47例，1分22例，2分5例，3分3例;肿瘤直径：≥5 cm 61例，<5 cm 16例;病灶数量：单发45例，多发32例;巴塞罗那（BCLC）分期：A期41例，B期17例，C期19例。
纳入标准：①所有患者均经临床评估、影像学检查、病理检查明确诊断为原发性肝细胞癌，存在肝炎后肝硬化病史;②所有患者均进行肝癌切除手术，术前未接受任何抗肿瘤治疗;③所有患者术后自愿接受随访，且随访资料完整。排除标准：①患有继发转移性肝癌、恶性肿瘤的患者;②存在严重感染、血液系统疾病的患者;③处于妊娠期、哺乳期的患者。本次研究已通过医院医学伦理委员会的批准。所有患者均自愿签署了知情同意书。
1.2方法
1.2.1仪器、试剂盒 试剂盒包括miRNA提取分离试剂盒及扩增试剂盒，仪器主要包括荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪。
1.2.2肝癌组织标本中miRNA提取方法 采用miRNA提取分离试剂盒，按照标签的加入量，加入无水乙醇去盐的漂洗液（RW）、去蛋白液的漂洗液（MRD）中。注意采集的癌组织与正常肝组织应距离3 cm以上。
1.2.3检测方法 应用逆转录和实时荧光定量PCR法进行检测，逆转录miR-375、U6;逆转录体积为155 μl，在42℃的条件下孵育30 min，在85℃的条件下孵育5 min。之后进行实时荧光定量PCR，得到循环阈值（Ct），内参为U6，以2-ΔΔCt法计算miR-375的相对表达量。
1.3观察指标及评价标准
观察肝癌患者的miR-375表达情况以及临床病理参数情况，通过相关性分析探讨miR-375表达情况与临床病理参数之间的关系。
肝功能Child-Pugh分级是一种对肝硬化患者肝脏储备功能进行评估的分级标准，等级越高，提示患者的肝脏储备功能越差，预后越差。ECOG评分，是从患者的体力来了解其一般健康状况和对治疗耐受能力的指标。ECOG体力状况评分分值越低，提示患者的体力状况越好。BCLC分期是一种肝癌临床分期系统，A期是指早期，B期是指中期，C期是指晚期。
1.4统计学方法
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析;采用Pearson系数进行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 miR-375表达情况
77例肝癌患者的癌组织中miR-375相对表达水平为（4.50±1.38），癌旁正常组织中的miR-375表达水平为（13.67±3.52）。患者的癌组织中miR-375相对表达水平低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（t=21.283，P=0.001）。
2.2肝癌组织miR-375表达水平与患者临床病理参数的关系
不同性别、年龄、肝功能Child-Pugh分级、ECOG评分、病灶数量、BCLC分期肝癌组织中的miR-375相对表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。但肿瘤直径≥5 cm肝癌組织中的miR-375相对表达水平低于肿瘤直径<5 cm，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。
2.3 miR-375相对表达水平与肝癌肿瘤直径的相关性分析
Pearson相关性分析结果显示，miR-375相对表达水平与肝癌肿瘤直径成负相关（r=-4.521，P<0.05），即miR-375相对表达水平越低，肿瘤直径越大。
3讨论
miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的、具有调控功能的非编码RNA，其参与了各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等[4-6]，其通过结合靶基因3端非翻译序列来对靶基因降解、抑制目标mRNA翻译过程进行抑制，进而对靶基因表达进行抑制[7];其还能对丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路、促癌基因（IGF）-Ⅱ和肿瘤细胞胰岛素样生长因子受体（ICF-IR）表达等调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡进行调控[8-9]，与肿瘤的发生、发展存在密切关系。
miR-375是一种抑癌基因，其与多种恶性肿瘤的发生、发展以及预后存在密切的关系[10-11]。miR-375在恶性肿瘤中呈低水平表达会促进恶性肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭以及转移，临床将miR-375作为癌症治疗靶点以及判断预后的重要标志之一[12]，在癌症治疗中具有重要意义。以往认为miR-375能够调节胰岛细胞发育和胰岛素分泌，之后发现miR-375在消化系统、泌尿生殖系统、妇科、口腔等肿瘤组织中呈低表达，且均比癌旁组织中的miR-375表达水平低，少数肿瘤组织的miR-375表达水平高于癌旁组织[13]。通过分析发现，miR-375具有诸多的作用：①其可以抑制肝癌新生血管的生成[14]：miR-375过表达会导致新生血管管腔形成密度减少;同时减少微血管出芽数目，进而能够对细胞的增殖、克隆形成、迁徙或侵袭能力进行抑制。②miR-375可对肝癌细胞中血小板源性生长因子（PDGFC）的表达进行抑制，miR-375过表达、下调表达可对PDGFC基因表达进行有效抑制、促进[15]。③miR-375在血小板源性生长因子非编码端（PDGFC3′-UTR）上特异性靶位点沉默PDGFC基因上直接作用，进而对PDGFC基因表达进行抑制，且能够抑制肿瘤细胞在低氧状态下清除损伤的线粒体。miR-375同PDGFC基因在肝癌组织中的表达为负相关[16-17]，能够对肝癌细胞的生长进行抑制miR-375通过靶向关键性的自噬相关分子抑制了低氧诱导的肝癌细胞的自噬[18-19]，并削弱其在低氧状态下的活性，说明通过调控miR-375干预低氧状态下肝癌细胞的自噬有望成为一种潜在的抗肝癌新策略。
本研究结果显示，77例肝癌患者的癌组织中miR-375相对表达水平低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05），提示癌旁正常组织中的miR-375充分发挥了抑癌作用，可阻止肿瘤细胞血管的生成。另外本研究结果还显示，不同性别、年龄、肝功能Child-Pugh分级、体力状况（ECOG）评分、病灶数量、巴塞罗那（BCLC）分期的肝癌组织中的miR-375相对表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。肿瘤直径≥5 cm的肝癌组织中的miR-375相对表达水平低于肿瘤直径<5 cm，差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关性分析结果显示，miR-375相对表达水平与肝癌肿瘤直径成负相关（r=-4.521，P<0.05）。这是因为miR-375水平的降低会导致肿瘤细胞的增殖、分化，无法较好地抑制肿瘤细胞向周围正常组织侵袭、转移，因此会增加肿瘤体积和直径。徐晓宏等[20]在其文章中提到，miR-200a、miR-148b、miR-375在原发性肝癌组中的表达水平显著下调，且miR-375会对p53、p21、PTEN等重要生物学途径产生影响。本研究还发现，随着乙肝表面抗原（HBsAg）表达水平的升高，miR-375表达水平会随之下降，另外在肝癌的诊断中，血清miR-375的诊断敏感性、特异性比癌抗原19-9（CA19-9）高。结合本研究结果，可知调高miR-375表达水平有助于手术治疗效果的提高，能够有效抑制肿瘤细胞的生长，从而降低复发率;当肝癌患者体内抑癌基因miR-375表达水平降低时，可通过分子靶向治疗来恢复患者体内组织的miR-375正常表达量，有助于患者生存期的延长，可将其作为肿瘤的治疗靶点之一。
综上所述，miR-375在肝癌中呈低表达水平，参与了肝癌的发生与发展，通过检测miR-375水平，可为临床治疗、诊断、预后判断提供有效的帮助。但本次研究中由于随访时间短，未对miR-375表达水平与肝癌患者生存率的关系进一步研究，有待于今后进行考察。
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（收稿日期：2019-04-19 本文编辑：孟庆卿）
