土槿乙酸诱导前列腺癌DU—145细胞周期阻滞的机制研究

后勤学院生药教研室陈虹教授鉴定并提供，无水乙醇溶解成母液，浓度为1 mmol·L^-1，-20 ℃避光保存，使用时用细胞培养液稀释至终浓度，培养液中无水乙醇终浓度低于0.1%；H-DMEM培养基为Gibco公司产品。胎牛血清由中国医学科学院血液学研究所提供。Trizol试剂由Invitrogen公司生产；四甲基偶氮唑盐（MTT），Hoechst33342，碘化丙啶（PI）和二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；PrimeScript^TM RT逆转录试剂为大连TaKaRa公司产品；一抗兔抗人cyclin B1，CDK1和cyclin D1多克隆抗体均购自Abcam公司，二抗购自KPL公司，ECL化学发光试剂购自Millipore公司。

1.3 仪器 Napco 5410 CO₂孵育箱（美国）；SUNRI SE全自动酶标仪（奥地利）；Olympus IX71倒置荧光显微镜（日本）；BD FACS-Calibur流式细胞仪（美国）；Roche lightcycle 1.5实时定量PCR仪（瑞士）；Bio-Rad水平、垂直电泳及转膜装置（美国）。

2 方法

2.1 细胞培养 人前列腺癌细胞株DU-145接种于H-DMEM培养液（含10%胎牛血清），置于37 ℃，5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养，孵育2～3 d后用0.25%胰蛋白酶消化传代，选对数生长期的细胞进行试验。

2.2 细胞增殖抑制检测（MTT法） 调整细胞密度为4×10⁴个/L，接种于96孔板，每孔加细胞悬液200 μL，培养24 h后作药物处理，实验组加入PLAB（终浓度分别为10，5，1，0.5，0.1 μmol·L^-1），同时设对照组（不加药）和空白组（只加培养基），每组设6个复孔，分别继续培养24，48，72 h，加 MTT 20 μL，4 h后加入DMSO 200 μL，避光振荡10 min，全自动酶标仪570 nm处测定各孔吸光度A。

2.3 Hoechst 33342荧光染色检测细胞死亡特征 5 μmol·L^-1 PLAB作用细胞12，24 h后收集细胞，Hoechst 33342荧光染色，荧光显微镜下观察细胞形态，照相记录。

2.4 流式细胞术检测细胞周期 0.5，1，5 μmol·L^-1PLAB作用细胞12，24 h后，分别收集细胞，PBS洗2次，75%冷乙醇固定，上机前弃乙醇，PBS洗1次，加入RNase 100 mg· L^-1，加入5 g·L^-1碘化乙啶（PI）染色剂，避光染色20 min，流式细胞仪检测细胞周期分布。

2.5 RNA提取和Real-time PCR检测cyclin B1，CDK1 mRNA表达 5 μmol·L^-1 PLAB作用细胞12，24 h后，收集细胞，Trizol法提取细胞总RNA，按PrimeScript^TMRT试剂盒操作合成cDNA。引物序列见表1，Real-time PCR反应体系为20 μL （上游引物 1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，SYBR green PCR master mix 4 μL，ddH₂O 12 μL）。扩增条件95 ℃ 变性10 min，94 ℃变性5 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共45个循环。荧光检测分析扩增曲线和溶解曲线，反应冷却至40 ℃，实验独立重复3次。根据Roche 1.5检测系统提供Cp（crossing point）值，ΔCp=Cp_Gene-Cp_GAPDH，ΔΔCp=ΔCp_treated-ΔCp_control，通过相对定量法（2^-ΔΔCt）计算各基因mRNA表达。

2.6 Western blot法检测cyclin B1，CDK1和cyclin D1蛋白表达 5 μmol·L^-1 PLAB作用细胞12，24 h后，收集细胞，预冷PBS溶液洗细胞2次，每孔加入100 μL细胞裂解液[含50 mmol·L^-1 Tris-HCl（pH 8.3），150 mmol·L^-1 NaCl，0.02%十二烷基硫酸钠，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%原矾酸钠，100 μmol·L^-1苯甲基磺酰氟溶液]，用细胞刮将细胞刮下，冰上裂解30 min，4 ℃低温12 000 r·min^-1离心15 min，吸取上清。样品采用BCA法蛋白定量，上样60 μg蛋白，进行SDS-PAGE，转移至聚氟乙烯（PVDF）膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入1∶1 000稀释的兔抗人cyclin B1，CDK1和cyclin D1多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育2 h，TBST洗涤，经ECL液化学发光，暗室X光片曝光，显影定影，重复实验3次，用Bandscan 5.0软件进行A分析。

2.7 统计学处理 实验数据用±s表示，用SPSS 11.5软件进行分析处理。2组数据间比较用t检验，组内数据用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 土槿乙酸对DU-145细胞增殖抑制作用 DU-145细胞经不同浓度PLAB处理后，均受到不同程度的抑制，并呈时间及剂量依赖性，其中药物作用24，48，72 h的IC₅₀分别为4.53，2.39，2.08 μmol·L^-1，见表2。

3.2 土槿乙酸可诱发DU-145细胞凋亡 经荧光染色后可见对照组细胞形态规整，核较大，核染色质均匀，被Hoechst 33342染成蓝色均匀一致荧光。给予5 μmol·L^-1PLAB处理的DU-145细胞12，24 h后，可见部分细胞呈现形态不规则，核染色质凝集，核膜破裂等凋亡细胞形态，且随着作用时间的延长，荧光明显增强，细胞凋亡比率由（18.11±1.50）%增加到 （34.89±2.49）%，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），见图1。

3.3 DU-145细胞周期变化 不同浓度PLAB作用DU-145细胞周期结果显示，作用12，24 h后， G₂/M期细胞所占百分比呈剂量依赖地增加，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05），并表现出时间依赖性，这说明PLAB可将DU-145细胞阻滞于G₂/M期，见表3。

3.4 DU-145细胞cyclin B1，CDK1 mRNA表达 通过相对定量法计算各实验组DU-145细胞的相关基因表达，5 μmol·L^-1PLAB作用DU-145细胞12，24 h 2个检测点中，cyclin B1基因水平分别是对照组的0.35，7.29倍；CDK1基因水平分别是对照组的2.89，3.04倍；结果显示5 μmol·L^-1PLAB阻滞于G₂/M时cyclin B1，CDK1呈高表达状态（P<0.05），见表4。

3.5 DU-145细胞cyclin B1，CDK1，cyclin D1蛋白表达 Western blot 结果显示，与对照组细胞cyclin B1（0.286 5±0.023 9），CDK1（0.294 5±0.032 7）和cyclin D1（0.402 9±0.075 6）相比，5 μmol·L^-1PLAB作用DU-145细胞12 h cyclin B1（0.286 8±0.025 8），CDK1（0.340 8±0.037 9）和cyclin D1（0.344 3±0.049 2），24 h cyclin B1（0.429 7±0.047 7），CDK1（0.364 7±0.045 6）和cyclin D1（0.252 9±0.036 1）后，细胞于G₂/M阻滞的同时，可见细胞周期cyclin B1，CDK1蛋白呈高表达状态，cyclin D1蛋白呈低表达状态，差异有统计学意义（P<0.05），差异尤其以作用24 h处理组更为明显（P<0.01），见图2。

4 讨论

前列腺癌是威胁男性生命的重要疾病，在2009年2月的第297号世界卫生组织实况报道中按全球死亡人数排序，前列腺癌位居男性肿瘤的第6位^[6]。中国仍是前列腺癌的低发国家，但近年来前列腺癌患者有逐年增加的趋势^[7]。前列腺癌发病隐匿，所以大部分前列腺癌检出时已属中晚期，且临床治疗效果常常不能令人满意，进展至雄激素非依赖性前列腺癌（AIPC）预后更差^[8]，在目前一段时间内细胞毒性药物仍是肿瘤药物治疗的主体。土槿乙酸的药理学研究及体内外实验均证实PLAB具有广泛的抗肿瘤活性，选择性抑制肿瘤细胞的生长，对正常细胞

生长无明显影响^[9-10]，活体无明显毒性。实验采用不同浓度PLAB作用于DU-145细胞，MTT结果显示PLAB能显著抑制DU-145细胞的生长，且抑制作用呈时间-浓度依赖性。

实验研究表明，许多抗癌药物对细胞周期有特异的阻滞作用^[11]，这种作用受多种调控基因精细而复杂的相互调控，这些基因最终是通过其表达的蛋白来实现对细胞增殖表型的直接调节。因此，本实验采用流式细胞分析技术，发现PLAB作用于DU-145细胞后，随着药物浓度的升高和作用时间的延长，细胞G₂/M期细胞比例明显升高。并在此基础上，进一步研究了与G₂ /M 期有关的细胞周期蛋白的改变。cyclin B1是与细胞G₂/M检测点有关的重要细胞周期调控因子。生理情况下，体内外信号激活cyclin B1后，cyclin B1在S期开始合成并在G₂期定位于细胞胞质，cyclin B1 的浓度在细胞内达到临界阈值后结合CDK1并磷酸化CDK1Thr160/Thr161，形成异源二聚体cyclin B1/CDK1，即细胞成熟促进因子（maturation promoting factor， MPF），促进细胞从G₂期进入M期，启动细胞有丝分裂^[12]。Yu等^[13]证实PLAB可以增加核内cyclin B1的表达，提高cyclin B1从胞浆向核内转运，并阻止核内的cyclin B1降解，而核内cyclin B1上调是M期周期阻滞的标志。Western blot结果显示，5 μmol·L^-1 PLAB处理DU-145细胞，随着时间进程，cyclin B1和CDK1表达均上调，cyclin D1表达下调。课题组推测PLAB引起DU-145细胞cyclin B1和CDK1表达升高，引发细胞内MPF分子的不断积聚，致大量处于S期时相的细胞进入G₂/M期，同时缺乏介导处于G₂/M期时相进入G₀/G₁期的cyclin D1，因此，发生细胞周期G₂/M期阻滞现象。提示这可能是PLAB抗肿瘤作用的机制之一，但其分子机制还不清楚，有待于进一步研究。

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Cycle arrest of prostate carcinoma DU-145 cells induced by pseudolaric acid B

MAI Xia^1，2， XU Zhong-wei¹， CHEN Xiao-yi¹， CAO Bo^2，3， XU Rui-cheng^1，2*

（1.Department of Cell Biology， Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces， Tianjin 300162， China；

2. Tianjin Key Laboratory for Biomarkers of Occupational and Environmental Hazard， Tianjin 300162， China

3. Department of Pharmacy， Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces， Tianjin 300162， China）

[Abstract] Objective： To study the effect of pseudolaric acid B （PLAB） on cell proliferation and cycle of human prostate carcinoma DU-145 cells. Method： Its inhibitory effect on the cell growth was measured by MTT method. Characteristics of cell death were determined by Hoechest 33342 staining. The cell cycle was detected by flow cytometry. The expressions of cyclin B1， cyclin D1 and CDK1 were detected by Real time-PCR and Western blot， respectively. Result： PLAB notably inhibited DU-145 cell growth in a dose- and time dependent manner （P<0.05）. Its IC₅₀ values of PLAB for DU-145 cells for 24， 48 and 72 h were 4.53， 2.39 and 2.08 μmol·L^-1， respectively. Having been treated with 5 μmol·L^-1 PLAB for 24 h， the cells showed such apoptosis characteristics as nuclei chromatin condensation and apoptotic body. With the increase in PLAB concentration， the proportion of G₂/M phase cells strikingly increased in a dose- and time dependent manner （ P<0.05）， meanwhile cyclin B1 and CDK1 showed over-expressions （P<0.05）， and the cyclin D1 showed under-expression （P<0.05）. Conclusion： PLAB can inhibit the growth of DU-145 cells and induce the cell cycle G₂/M arrest， accompanied with the over-expression of cyclin B1 and CDK1， which may be related with its regulation cycle-associated protein degradation.

[Key words] pseudolaric acid B； human prostate carcinoma cell； cell cycle； cyclin B1； CDK1； cyclin D1

doi：10.4268/cjcmm20122225

[责任编辑 张宁宁]

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