[摘要] 目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)的表达与肾血管性高血压(RVH)大鼠心肌肥厚的关系，探讨CTGF在RVH大鼠心肌肥厚发生、发展过程中的作用。方法：用两肾一夹方法构建RVH大鼠模型。构建成功的RVH大鼠随机分为RC1及RC2组，同时设置对照组（SC组）。以心肌胶原含量、左心室重量(LVW)、左心室重重与体重比值(LVW/BW)作为心肌肥厚的指标，应用免疫组化法检测CTGF蛋白的表达。结果：①RVH大鼠术后第8周出现心肌肥厚，第12周进一步加重。②RC1和RC2 组CTGF蛋白表达显著增加（较假手术组）；且RC2较RC1组大鼠CTGF蛋白表达增加更显著。结论：肾血管性高血压大鼠CTGF表达增多，提示CTGF参与了肾血管性高血压大鼠心肌肥厚的发生。
[关键词] 高血压；肾血管性；心室肥厚；结缔组织生长因子
[中图分类号] R544.1+4[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2008）07（b）-013-03
The relation between connective tissue growth factor and ventricular hypertrophy in the rats with renovascular hypertension
SUN Hong-lei1，ZHANG Jing-qun2，MA Ye-xin2
(1.Central Hospital of Jiaozuo Coal Group Co.Ltd.，Jiaozuo 454150，China；2. The Affiliated Tongji Hospital，Tongji College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China)
[Abstract] Objective:To study the relation between connective tissue growth factor and ventricular hypertrophy in the rats with renovascular hypertension. Methods: Some two-kidney one-clip (2K1C) renovascular hypertension（RVH）rats were established. Then they were randomly divided into two groups:RC1 and RC2. In addition，sham-operated rats were designed as controls(SC). The left ventricular weight(LVW) and the ratio of left ventricle weight to body weight(LVW/BW) were measured when the rats were killed at the endpoint of the study. The CTGF protein in the left ventricular myocardium were assayed by immunohisto- chemical methods. Results: ①Significant ventricular hypertrophy appeared at the 8th week and became more serious at the 12th week after surgery.②The expression of CTGF protein in the left ventricular myocardium increased significantly in RC1 rats and RC2 rats(compared with the sham rats)，and the expression of CTGF protein in RC2 rats increased more significantly than in RC1 rats. Conclusion:Increased expression of CTGF protein in left ventricular myocardium of rats with renovascular hypertension indicate that CTGF may play important roles in the development of ventricular hypertrophy of RVH rats.
[Key words] Hypertension；Renovascular；Ventricular hypertrophy；Connective tissue growth factor
高血压是一种与遗传和环境因素密切相关的以血压增高为主要临床表现的综合征，主要累及心、脑、肾、大动脉及外周血管等组织器官，引起心肌肥厚、心力衰竭、脑卒中、肾功能不全等一系列疾病，是引起机体致残、致死的元凶。如何预防和逆转左室肥厚是人们一直努力探讨的问题。结缔组织生长因子（CTGF）是新近发现的分泌性多肽，具有多种多样的生物学特性，在体内参与胚胎发育、细胞增生、分化及创伤愈合等。CTGF可促进细胞的黏附、增生、和细胞外基质形成[1]。相关研究表明，高血压可引起心肌CTGF mRNA表达增加，且CTGF mRNA的表达与心肌肥厚的程度密切相关[2]。本研究旨在探讨CTGF在RVH大鼠心肌肥厚发生、发展过程中的作用。
1材料与方法
1.1 实验动物模型制作与分组
雄性SD大鼠若干只随机分组。
两肾一夹手术组：两肾一夹方法构建肾血管性高血压模型[3]。3%戊巴比妥钠（30~50 mg/kg）麻醉下，沿腹白线作正中切口打开腹腔，分离左肾动脉，用一内径为0.20 mm的银夹使之部分缩窄；术后前4周每周检测清醒安静状态下尾动脉收缩压（SBP）（鼠尾动脉测压仪：Rat Tail NIBP System，ADI Instruments），如SBP较术前升高≥20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，且高于140 mmHg为造模成功[3，4]。
假手术对照组：实行同样的手术操作，但是不缩窄肾动脉。
造模成功大鼠20只随机分成2组：RC1组和RC2组。同时设假手术对照组(SC组)。RC1组观察8周，RC2组观察12周。研究终点称动物体重(BW)后处死，称取左心室重量(LVW)。
1.2大鼠心肌胶原纤维形态学观察
取心肌冠状沟下约1 mm处，横切心肌标本约5 mm厚，纱布吸干血迹后，用10％福尔马林固定，石蜡包埋，制片。切片行VG胶原染色，用HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统（湖北武汉千屏影像公司）进行拍照，随机取10个视野测量，计算其均值，求取心肌组织胶原容积积分(CVF=胶原面积/总面积)。
1.3 免疫组化染色法检测TGF-β、CTGF的表达
心肌组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚切片。按照S-P方法，步骤如下：切片脱蜡入水，蒸馏水洗5 min，PBS洗5 min×2次，滴加1滴3%H2O2溶液，38℃放置15 min，PBS洗5 min×3次，抗原修复液(9 ml 0.1mol/L枸橼酸溶液＋41 ml 0.1mol/L枸橼酸钠溶液＋450 ml水)水浴加热，煮沸10~15 min，冷却后PBS洗5 min×3次，滴加正常山羊血清封闭，室温30 min，甩净不洗，滴加兔抗大鼠CTGF多克隆抗体（1︰100工作浓度，武汉博士德），4℃孵育过夜，PBS洗3 min×3次，滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃静置30 min，PBS洗3 min×3次，滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃静置30 min，PBS洗3 min×3次，DAB染色3~5 min，苏木素复染，盐酸酒精分化，PBS返蓝，常规脱水透明，中性树胶封片，镜检。使用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行分析。随机选取每张切片至少10个视野（×200倍）自动选取阳性区域并计算平均光密度值.
1.4 统计学处理
数据资料以x±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析及相关分析，以P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 鼠尾动脉压
各组术前SBP无明显差异，术后SBP：SC组较术前无明显变化，RC1、RC2组术后1周尾动脉压开始升高，4周显著增高，与SC相比有显著性差异（P＜0.01），RC1与RC2相比无显著性差异（P＞0.05），提示RVH模型成功（表1）。
2.2左心室重（LVW）、左心室重与体重比值(LVW/BW)
RC1组与SC相比，LVW、LVW/BW分别增加了38%、49%；RC2组LVW、LVW/BW进一步升高（P＜0.01）。
2.3 VG胶原染色
采用VG胶原染色法使大鼠心肌胶原染色，SC组可见心肌间质内少许散在的细丝状红色胶原，RC1组间质内可见较粗大的波状纤维束，RC2组间质内见粗大的波状纤维束聚集成板状，形成瘢痕灶，取代原来的心肌细胞。表明肾血管性高血压组随着时间的推移，心肌纤维化程度明显加重(图1)。
2.4 心肌组织CTGF的表达
免疫组化染色法表明，CTGF主要在心肌胞浆及间质细胞表达，SC大鼠心肌胞浆内可见少量淡黄色颗粒物，呈弱阳性。RC1和RC2心肌组织内见大量棕黄色颗粒，呈强阳性（P＜0.05）。RC2与RC1相比，棕黄色颗粒更粗大，平均光密度值升高更明显（表2）。
2.5 相关分析
把各组的CTGF的蛋白水平与相应的纤维化指标(LVW、LVW/BW、CVF)进行相关分析，结果显示CTGF与LVW （r=0.642，P＜0.05)、LVW/BW（r=0.627，P＜0.05)、CVF(r=0.779，P＜0.05）均呈正相关。
3讨论
两肾一夹肾血管性高血压（RVH）心肌肥厚是体液因素介导的心肌肥厚模型，主要是由于肾动脉狭窄，肾脏缺血，激活了肾素-血管紧张素-醛固酮系统，从而引起血压持续性增高。因此，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在该模型中明显增高，是研究血管紧张素介导的终末器官损害的模型系统[4]。由于心肌细胞的肥大，成纤维细胞增生，间质、血管的重构，使心肌顺应性降低，出现舒张功能不全，最终导致泵功能衰竭，研究表明，上述表现与心肌纤维胶原的重构，即心肌纤维化的形成密切相关[5]。
本实验构建两肾一夹RVH大鼠模型，术后1周尾动脉压开始升高，4周显著增高。假手术组术前术后血压无变化，即本实验模型是成功的。通过对心肌进行VG胶原染色，并以左心室重、左心室与体重比作为心肌肥厚的指标来进行观察。在试验中发现，术后8周RVH组大鼠开始出现心肌肥厚，12周进一步加重，心肌中见明显瘢痕灶，提示术后2~3个月，大鼠正处于心肌肥厚进展形成期。在心肌肥厚的同时，心肌中出现了CTGF mRNA表达的上调和蛋白的表达增多，且随着时间的延长，CTGF mRNA和蛋白的表达增多更明显，提示CTGF参与了两肾一夹肾血管性高血压心肌肥厚的形成。
1991年人类CTGF首次从培养的人脐静脉内皮细胞分离出。研究表明，在生理状态下，机体组织可有基础量CTGF分泌；而在病理状态时，CTGF的过度表达与某些纤维化或增生性疾病的发生密切相关。CTGF主要刺激某些细胞的趋化、黏附及促进细胞外基质形成，增加成纤维细胞和内皮细胞增殖，诱导血管内皮细胞的凋亡[6]。Dominika 等[7]发现在成纤维细胞中通过AngⅡⅠ型受体的激活，AngⅡ能引起CTGF mRNA和蛋白的迅速表达，CTGF可能是抗纤维化的一个靶点。已有研究发现，自发性高血压大鼠在低盐饮食状态下，心肌CTGF mRNA表达水平增高，表明高血压可引起心肌CTGF mRNA增加。同时还观察到在高盐饮食的状态下，其心肌CTGF mRNA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因表达较低盐饮食时增加更显著，且该作用可分别被AT1受体拮抗剂及其他药物部分抑制[8]。
本实验发现，CTGF mRNA和蛋白在肾血管性高血压心肌肥厚大鼠中表达异常增高，主要在心肌细胞、间质及瘢痕组织中，随病程延长其表达进一步增加，而此时血压并无进一步的增加。提示CTGF参与了肾血管性高血压大鼠心肌肥厚的发生、发展，而不依赖于血压的升高程度。
[参考文献]
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[8]Prado GN，Taylor L，Piserchio A，et al. Global chimeric exchanges within the intracellular face of the bradykinin β2 receptor with corresponding angiotensin Ⅱ type Ia receptor regions: generation of fully functional hybrids showing characteristic signaling of the AT1a receptor[J].J Cell Biochem，2002, 85: 809-819.
（收稿日期：2008-01-30）
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