摘要：概述了代谢组学的技术手段及代谢组学在烟草（Nicotiana tabacum）香味物质研究中的应用现状，并展望了代谢组学在烟草香味物质研究领域的发展趋势。
关键词：烟草（Nicotiana tabacum）；代谢组学；香味物质；交叉研究
中图分类号：TS41+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5248-05
Review and Prospect of Metabonomics in the Research of Tobacco Aroma Composition
FENG Ji，YU Jun，CAI Chang-chun
（Research Center of Tobacco Biotechnology Engineering， Hubei Tobacco Research Institute， Wuhan 430030， China）
Abstract： Metabonomics， developed from the late 20th century， is a new discipline comprehensively researching on all metabolites in organisms. It is to analyze qualitatively and quantitatively and reveal the mechanism of metabolism in organisms. Although metabonomics has been developing rapidly in recent decades， the application of metabonomics on research of tobacco （Nicotiana tabacum） aroma composition is still in the primary stage. The technical methods and progress on aroma composition in tobacco were reviewed； and the prospects of the application of metabonomics on the research of tobacco aroma composition were looked forward.
Key words： tobacco（Nicotiana tabacum）； metabonomics； aroma composition； crossed research
随着烟草基因组测序的完成（测序品种为野生种绒毛状烟草Nicotiana tomentosiformis、林烟草N. sylvestris和栽培种红花大金元N. tabacum），人们逐渐从烟草结构基因组学（以建立高分辨率的遗传和物理图谱为主）向烟草功能基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学过渡。代谢组学（Metabonomics）是继转录组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科，是系统生物学的重要组成部分。代谢组学的概念来源于代谢组，而要了解代谢组则必须先了解代谢（Metabolism）和代谢物（Metabolite）。代谢是指生物体内所发生的用以维持生命的一系列有序的化学反应总称。在代谢过程产生或消耗的小分子物质（分子质量1 000 u以内）叫做代谢物，不包括生物大分子物质。因此，代谢物的分析是从分子水平上研究生物体生命活动的一个重要突破口。代谢组学是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标，对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有代谢物进行定性和定量分析的一门新学科[1]。
烟草中的香味物质是以烟草植株体内初生代谢前体物为原料，经一系列酶的催化作用发生生理生化反应所形成的一类次生代谢产物。目前从烟叶组织中已鉴定出的代谢物有3 000多种，其中与香味有关的代谢物有700余种[2]。这些香味物质的分子里含有羟基、巯基等特定致香功能基团，使烟叶组织散发出令人愉悦舒爽的香味。按照特定致香功能基团不同，烟草香味物质可分为有机酸类、酚类、脂质类、甾醇类、萜类、杂环类等代谢物[3]。如此种类繁多的烟草香味代谢物给研究带来了一定的困难。然而利用代谢组学的技术手段，将这数百种不同种类的香味物质作为一个整体研究对象，通过高通量的分析仪器进行检测，对所获得的大量数据进行相应的整合处理，从中了解和掌握烟草中所有香味物质代谢变化规律，可有效地判断和预测烟草香味物质的代谢变化，为培育不同香型烟草品种服务。因此，将代谢组学研究技术应用于烟草香味物质研究中是十分必要的[4]。
1 代谢组学的技术原理
代谢组学研究技术具有高灵敏度、高通量和无偏向性等特点。近红外光谱（Near infrared spectroscopy，NIR）分析技术是近年来代谢组学研究领域快速发展的一种高效分析技术，该技术是将一束不同波长的红外射线照射到标准样品上，某些特定波长的红外射线被样品吸收而形成该样品的红外吸收光谱，然后利用近红外光谱所反映的样品基团、组成或物态等信息构建校正模型，以此来实现对未知样品的定性或定量分析。在烟草香味物质研究中，研究人员收集数百份具有代表性样品的光谱数据，以此建立相应指标的近红外模型用于测定烟草重要香味成分。研究结果表明，近红外光谱分析技术作为一种简便、高效、低消耗的绿色分析技术用于测定烟草中重要香味物质成分是可行的[5，6]。然而，该技术需要大量有代表性样品建立模型，同时需要根据仪器的改变或标准样品变化不断更新模型，这些因素大大缩小了近红外光谱分析技术的使用范围。
色谱法是另一种高效的分析手段，具有高分辨能力、高灵敏度和高分析速度等特点，是分析复杂混合代谢物的主要手段[7]。但是在进行定性和定量分析时，由于色谱法主要依据保留的出峰值，很难对那些未知复杂的代谢物做出定性分析，因此需要借助于其他仪器进行辅助分析。而质谱分析法是一种将分子电离成不同的带电荷离子，然后按质荷比将其分离和检测，从而推断分子结构的分析方法[8]。虽然质谱分析法具有很强的结构分析和鉴定能力，但是这种方法只能够对单一的组分给出良好的定性结果，对那些复杂混合的代谢物不具备分离解析能力。因此，色谱与质谱联用技术既可以发挥色谱法和质谱法各自的优势，同时也相互弥补了各自的不足。气相色谱与质谱联用技术（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）于1957年首次得以实现[9]，并且得到迅速的发展。该方法主要适合于复杂的混合代谢物中未知组分的定性分析，判断代谢物的分子结构。这种方法灵敏度高，分析速度快，重复性好，但不足之处是对样品中难挥发或是极性较大的代谢物进行分析之前，需要将样品经过衍生化处理。液相色谱与质谱联用技术（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）可以很好地解决这个问题[10]。与GC-MS相比，LC-MS更适合于分析那些沸点高、分子大、热稳定差或极性强的代谢物。在已知的植物代谢物中大约70%的代谢物是不挥发的，因此LC-MS比GC-MS有更加广阔的应用前景。但是LC-MS和GC-MS各有所长，应相互补充。目前在烟草的香味物质分析研究中，GC-MS的应用较广泛，大部分烟草香味物质是由GC-MS分析技术检测出来的[11]。
2 代谢组学在烟草香味物质研究中的应用
2.1 烟草香味物质成分的鉴定
在20世纪五六十年代，科研人员就着手对烟草香味物质成分进行分离检测，但由于分离检测技术手段的限制，相关研究未能取得实质性突破，人们对烟草香味物质的认识始终停留在初级水平。随着气相色谱、液相色谱、质谱等代谢组学研究技术的发展和普及，使得科研人员能够在高通量水平上对烟草香味物质成分进行分离、鉴定以及相应研究。1976年，Lloyd等[12]借助蒸馏萃取技术从烤烟烟叶和烟丝中提取出香精和精油，并将它们分成若干组分，利用GC-MS技术并结合近红外、核磁共振等技术，对香精和精油中香味物质进行了研究，分离鉴定出羧酸类、醇类、醛类、脂类等共计12类323种代谢物（香精中含有195种，精油中含有228种），其中275种是在烤烟中首次发现的，132种未在其他类型烟草中被发现。Demole[13，14]等采用水蒸气蒸馏、溶剂提取和真空蒸馏技术对白肋烟中的挥发性和半挥发性香味物质进行提取，通过GC-MS技术对提取物进行检测分析，共鉴定193种代谢物，其中81种代谢物首次在烟草中被鉴定，确定大马酮和二氢大马酮为重要的香味物质。Schumacher[15]以马里兰烟为研究材料，利用GC-MS技术对其提取液进行检测分析，鉴定出142种马里兰烟香味物质，并将这些香味物质与烤烟、白肋烟的香味物质进行比较分析。
我国对烟草香味物质成分分离检测研究起步较晚，但近20年我国科研人员检测烟草香味物质成分的研究也取得了较大的进展，分离鉴定出一批与烟草香气有关的代谢物。刘百战等[16]借助顶空分离法从不同部位、成熟度及颜色的云南烤烟中提取香味物质，并利用毛细管气相色谱技术对提取液进行测定分析，共检测到14种香味物质。谢剑平等[17]采用蒸馏萃取技术从国产（湖北鹤峰、重庆奉节）和进口（巴西、津巴布韦和马拉维）白肋烟烟叶中提取出香味物质，用GC-MS技术对提取液中的酸性、碱性和中性香味物质进行了分析，总共鉴定出200种香味物质，其中有30种代谢物在烟草香味物质研究中尚未报道。吴新华等[18]采用超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱（UPLC-ESI-MS/MS）技术并在多反应离子监测（MRM）模式下，分离测定了7种烟草的香味物质。
利用代谢组学技术对烟草香味物质成分的鉴定研究，在很大程度上提高了对烟草香味物质的认识，证实了不同香型烟草间的香味物质成分存在显著的差异[19]。代谢组学研究技术为烟草香味物质研究提供了一种准确客观的检测技术，为今后深入研究不同烟草类型间、不同品种间、不同地方种植同一品种间主要香味物质的差异及其形成原因提供了可能的手段。
2.2 不同基因型烟草香味物质的比较
在影响烟草香味物质合成与积累的因素中，基因型是最重要的因素，它可通过烟草体内基因表达调控直接影响烟叶的香味[20]。如烟草品种的基因型存在缺陷，无论采取怎样的栽培技术和其他措施，其体内不产生或合成较少香味物质，导致该烟草的香气质和量上都存在不足。因此，要获得香气品质优良的烟草品种，必须鉴别区分不同基因型烟草材料之间的香味物质差异，对评价筛选优良特色烟草材料有重要作用。常爱霞等[21]利用蒸馏萃取以及GC-MS技术对特香型烤烟、香料烟和烤烟3种类型的烟叶进行了挥发性致香成分的检测分析，发现特香型烤烟与烤烟的差异相对较小，而与香料烟存在着较大差异。汪耀富等[22]采用GC-MS技术对中国推广种植的5个不同基因型烤烟品种的香味物质含量进行了比较分析，证明不同基因型烤烟叶片间香味物质的含量差异较大。席元肖等[23]应用LC和GC-MS技术，对中国18个产区68个产烟县的初烤烟叶样品的香味物质进行代谢组学分析。结果表明香型烤烟的叶黄素、类胡萝卜素、新绿原酸、芸香苷等共13种香味物质的含量显著较高；浓香型烤烟的绿原酸、香叶基丙酮、苯乙醛、苯甲醛、巨豆三烯酮等共7种香味物质的含量显著较高；中间香型烤烟大部分香味物质含量居中。因此，基因型对目标香型烤烟品种的选育有十分关键的影响。
2.3 不同生态环境烟草香味物质的比较
烟草中香味物质合成与积累易受外界环境影响，光照、温度、水分、海拔、气候等因素是影响烟草香味物质的重要因素[24]。因此，监测不同环境中的烟草香味物质的变化，可以了解不同的外界环境对烟草体中香味物质合成与积累的影响。杨兴有等[25]使用NIR、HPLC和GC-MS分析技术对不同光照处理过的烤烟材料进行分析。研究结果显示，中性香味物质总量随光照减弱而明显增加，但当光照减弱到一定程度，中性香味物质又开始减少。水分是烟草生长发育不可或缺的条件，但降水量和土壤中水分含量对烟草烟叶香味物质的影响却是相反。例如采用HPLC分析技术对烟草叶片的香味物质进行分析，研究发现增加田间灌水量能显著提高烟草叶片产生香味物质，而降雨则能淋洗大量烟叶表面脂溶性香气物质[26，27]。杨虹琦等[28]采用HPLC分析技术对来自于云南、贵州、福建、河南、黑龙江5省共10个地区的烟叶材料进行分析。研究表明，随着纬度的降低和海拔高度的升高，烤烟中类胡萝卜素含量逐渐升高。
2.4 不同栽培与调制方式烟草香味物质的比较
不同栽培措施对烟草中香味物质合成与积累影响较大，只有根据各烟区自身的环境条件，找到合适的栽培方式，最大限度地发挥各烟区的自然优势，使各烟区烟叶具有不同风格特色的香味。例如烟草种植密度和叶片数影响着烟叶中性香味物质的含量。因此，赵铭钦等[29]采用GC-MS分析技术在延边烟区对种植密度和留叶数不同的烟草进行检测分析。结果表明，不同种植密度和留叶数对烟叶中性致香物质含量的影响不同，其中当密度为120 cm×50 cm、留叶数为18片/株时，烟叶中性香味物质含量最高，香气质量较好，适宜在延边烟区生产中推广应用。
烟叶调制过程是香味物质前体物降解、香味物质形成和转化的主要时期。因此探索优化调制过程中的条件，最大限度促使烟叶内香味物质前体物大量转化，使得更多的特色香味物质彰显出来。Weeks等[30]运用GC-MS技术分析发现烟叶在调制过程中香味物质新植二烯含量显著增加，但陈化时间过长，其含量则下降，表明新植二烯可发生进一步代谢反应。宫长荣等[31]利用GC-MS技术研究不同烘烤条件下的烟叶香味物质含量，认为以低温慢烤烟叶中香气物质损失较少，内在品质较好。
2.5 代谢组学与其他学科的交叉应用
随着各个学科研究的深入，科学家们逐渐认识到基因组、表达组和蛋白质组水平上的变化不一定能够对烟草香味物质产生实质的影响。而烟草体代谢产生的代谢产物才是烟草体中新陈代谢的最终结果，能够准确反映烟草体中状态，因此只有将各个学科所获得的相关信息联系起来，才能从整体水平研究烟草香味物质对环境变化的响应[32]。任何单一方面的研究对烟草香味物质的理解都是不全面的，因此烟草代谢组学与其他学科的交叉研究是必然趋势。
将代谢轮廓分析与遗传学、基因组学结合在一起展开研究，是烟草代谢组学与遗传学、基因组学交叉领域新兴的研究方向。常爱霞等[33]采用蒸馏萃取和GC-MS分析技术，对有特殊香气大白筋599和具有一般香气的G28烤烟烟叶进行全面代谢轮廓分析，共检测到67种香味物质，其中55种为二者共有，且大白筋599有25种香味物质含量高于G28。剩下12种香味物质为品种特有，其中8种为大白筋599所特有，4种为G28所特有。进一步的遗传分析表明大白筋599的特异香味物质是由单显性基因所控制。另外，有人采用代谢组学与基因组学研究方法对香料烟香味物质进行研究，发现香料烟特征性香味物质是雪松-琥珀香，该代谢物受一个位于A染色体上的基因控制[34]。
由于烟草中大多数香味物质的含量较低，通过育种工程增加某类物质的含量需要漫长时间且效果也不明显，无法在短期内快速有效地改善烟草的香味品质。因此，通过基因工程技术将某些特定的基因导入烟草基因组内或使用农杆菌转化烟草而获得转基因植株，可以快速有效提高烟草的香味品质[35]。李雪君等[36]采用GS-MS分析技术，对转法呢基焦磷酸合酶（Farnesyldiphosphatesynthase，FPS）基因烟草株系（K-4、K-6、K-17、K-35）和未转基因对照的烤后烟叶中类胡萝卜素含量及萜烯类香味物质含量进行分析，研究发现与未转基因对照相比，转基因烟草株系烤后烟叶中8种类胡萝卜素降解产物及茄酮、新植二烯含量都有不同程度的提高，结果表明外源FPS基因在烟草中的表达对烟草香味物质的合成具有促进作用，有利于烟叶品质的提高。
结合细胞生物学研究方法，利用植物细胞培养技术获得高产细胞系，通过调节培养基、激素、光照、温度、胁迫因子等培养条件对培养的细胞系进行处理，最终应用代谢组学研究技术得到稳定可靠的试验数据。Chappeil等[37]采用GC-MS分析技术对处理过的烟草悬浮细胞和未处理对照的细胞培养液进行分析，结果认为向烟草悬浮细胞中加入真菌细胞壁碎片后会导致细胞培养液中香味物质倍半萜产物的积累增加。
3 展望
代谢组学是进行烟草香味物质研究的主要手段之一，目前在烟草香味物质的检测分析以及相关基因功能的研究等方面取得了很大的成功。但从总体来看，代谢组学在烟草香味物质研究中的应用仍然处于发展阶段，在方法学和应用两方面均面临着极大的挑战。
在方法学研究方面，烟草香味物质的复杂性使得研究人员对分析技术的灵敏度、分辨率、动态范围和通量提出了更高的要求[38]。代谢组学研究的深入得益于分析技术的不断发展，如高分辨质谱、超高效液相色谱与质谱联用、毛细管液相色谱与质谱联用和多维核磁共振技术等的使用，为代谢组学在烟草香味物质研究中的应用提供了更加广阔的空间。但是由于缺乏可通用的标准数据库，一定程度上限制了这些技术在烟草香味物质研究中的应用范围。因此完善的烟草香味物质数据库的构建及相应研究的标准化等越来越受到关注。在应用方面，如何从大量的烟草香味物质中找出特异性的香味物质（特别是低丰度的香味物质）是烟草代谢组学发展的瓶颈。能否克服此瓶颈是决定此技术能否广泛应用的一个重要因素。
由于烟草代谢组学存在着这些制约因素，将烟草代谢组学与其他学科整合交叉研究，并且相互验证，是学科发展的必然趋势。目前的研究均是将其他组学两两结合起来研究，如将其他学科全部结合成为一个有机体对烟草香味物质进行研究，将会使烟草香味物质的研究提升到一个前所未有的深度。如“烟草基因组计划”（我国《烟草行业中长期科技发展规划纲要（2006-2020年）》中确定的9个科技重大专项之一）将大规模开展烟草基因组测序和全基因组序列图谱的绘制、揭示基因表达调控的机制、阐明蛋白质组分的表达及功能模式、探索代谢产物变化规律及构建相应的代谢调控网络等，以实现烟草基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等数据的整合，建立全面系统的烟草生物信息学数据库，提高对烟草复杂生物学调控网络的认识，这也是未来烟草香味物质研究的重要趋势[39，40]。
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（责任编辑 王贵春）
