摘要：多药耐药（multidrug resistence，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因，多年来学者一直致力于多药耐药机制的研究。神经酰胺作为细胞凋亡的第二信使，参与多种细胞凋亡，它与凋亡相关因子bcl-2、NF-κB的关系一直是研究的重点。葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase，GCS）可催化神经酰胺糖基化使其转变为葡萄糖神经酰胺，许多研究证明GCS与MDR表型有关。
关键词：多药抗药性；神经酰胺；bcl-2；NF-κB；葡糖神经酰胺合酶
中图分类号： R730.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)05-46-04
Ceramide Metabolism and Its Relationship with Multidrug Resistance of Tumors
HU Ping-ping, TIAN Bo, CHEN Tong-yu
(Department of Pathology, the Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou 213003, China)
Abstract：Multidrug resistance is considered to be the main obstacle to the effective chemotherapeutics, which has been investigated for years in the medical field. Ceramide functions as a second messenger to several signaling pathways, and the relationship between it and bcl-2 or NF-κB has always been emphasized. Glucosylceramide synthase(GCS)catalyzes the glycosylation and inactivation of ceramide to glucosylceramide, which has been proved to be responsible for MDR phenotype.
Key words：multidrug resistance; ceramide; bcl-2；NF-κB; glucosylceramide synthase
多药耐药（multidrug resistence，MDR）是指一种药物作用于肿瘤产生耐药后，此肿瘤对未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。MDR形成是肿瘤免受化疗药物攻击的细胞防御机制，也是肿瘤化疗失败的主要原因。在细胞代谢中神经酰胺（ceramide）的重要性已被广泛探讨，它在不同细胞中表现的生物效应不同，如分化、凋亡、生长停滞、细胞因子合成和分泌、免疫反应等，其诱导细胞凋亡的作用是Obeit等[1]用C2神经酰胺处理U937细胞时发现的，从此引起了学者们的极大兴趣。研究显示，神经酰胺代谢功能失调可引起肿瘤细胞多药耐药，现就神经酰胺及其代谢的关键酶葡糖神经酰胺合酶（glucosyl-ceramide synthase，GCS）与多药耐药的关系作一综述。
1神经酰胺的代谢
1.1神经酰胺的产生
主要有两条路径，（1）从头合成：在内质网，二氢鞘氨醇在神经酰胺合酶催化下发生酰化作用，形成二氢神经酰胺，后者经二氢神经酰胺还原酶作用，转化为N-脂酰鞘氨醇，即神经酰胺，这是细胞内基础水平神经酰胺生成的重要途径；（2）神经酰胺由酸性或中性鞘磷脂酶（sphingomyelinase，Smase）水解细胞膜的组成成分鞘磷脂生成，经鞘磷脂酶催化磷酸二脂键，水解鞘磷脂产生神经酰胺和磷酸胆碱，两者又能在神经酰胺胆碱磷酸转移酶作用下合成鞘磷脂。由于此过程可逆，称为“鞘磷脂循环” [2]，此途径是调控第二信使神经酰胺细胞水平的主要方式。其他途径有：神经鞘氨醇在神经酰胺合酶催化下生成神经酰胺；脑苷脂类在脑苷脂酶作用下可降解生成神经酰胺。
1.2神经酰胺的去路
（1） 经神经酰胺激酶作用，分解为神经酰胺-1-磷酸；（2）经鞘磷脂合酶作用，分解为鞘磷脂；（3）在细胞膜及高尔基复合体（Golgi complex），经GCS作用，神经酰胺发生糖基化，生成葡糖神经酰胺；（4） 神经酰胺在神经酰胺酶的作用下脱酰基为鞘氨醇，鞘氨醇经鞘氨醇激酶作用，分解为具有促进细胞增殖作用的鞘氨醇-1-磷酸（S1P）；（5）经鞘磷脂合酶（sphingomyelin synthase，SMS）作用，将磷酰胆碱头部基团由磷脂酰胆碱转移到神经酰胺生成鞘磷脂。
2神经酰胺与细胞凋亡的关系
鞘磷脂代谢产物神经酰胺作为凋亡的调节剂和细胞应激反应的共调节剂引起了学者们的广泛兴趣。临床常用的药物如阿霉素、紫杉醇、鬼臼乙叉苷、长春新碱、放线菌素D[3]、肿瘤坏死因子、Fas抗体、热休克和辐射等凋亡诱导应激因素都能使细胞内神经酰胺水平升高[4]。
神经酰胺介导的细胞信号转导可产生细胞周期停滞、末端细胞分化和凋亡。神经酰胺和其它鞘类磷脂作为第二信使，调节许多能诱导酶活性和转录活性级联放大作用的靶蛋白的作用。神经酰胺活化蛋白激酶（ceramide-activated protein kinase，CAPK）是具有特征性神经酰胺作用的靶蛋白，其他下游靶蛋白有神经酰胺活化蛋白磷酸酶（ceramide-activated protein phosphatases，CAPPs）、GTP结合蛋白raf-1和蛋白激酶C（PKC）等[5]。这些蛋白质通过激活丝裂原活化的蛋白激酶途径参与增殖和炎症作用，也可通过激活应激活化蛋白激酶c-jun N-末端激酶（SAPK/JNK）途径[6]。SAPK/JNK途径激活AP-1核因子活性，此因子能促进各种基因转录活化，为凋亡所必需。研究表明，用JNK-1或c-jun反义寡核苷酸或用高浓度的c-jun突变体阻断SAPK/JNK/AP-1通路，都能阻滞神经酰胺介导的凋亡作用[7]。内涵体/溶酶体的组织蛋白D也是神经酰胺结合蛋白，神经酰胺在这些结构中诱导蛋白酶释放到胞浆，并启动导致凋亡的蛋白质水解级联反应[8]。线粒体是神经酰胺诱导凋亡的重要调节结构，神经酰胺产生反应氧簇可通过线粒体膜表面小孔形成[9]，诱导细胞色素C释放直接作用于离体的线粒体和完整的细胞，神经酰胺生成减少可使细胞对阿霉素、肿瘤坏死因子-α及离子辐射引起的凋亡产生耐受。
3肿瘤细胞的多药耐药
20多年来，学者们一直致力于多药耐药形成机制的研究，现已基本明确与以下因素有关：（1）通过改变细胞膜或胞浆与细胞核之间药物的摄入和外流，使细胞内药物浓度达到亚致死水平，膜蛋白转运介导耐药，如P糖蛋（P-glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-related protein，MRP）、肺耐药蛋白（lung resistance-related protein，LRP）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等；（2）细胞内药物激活或灭活改变引起代谢耐药，如谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽-S-转移酶和P450家族等；（3）细胞内药物靶酶，如拓扑异构酶Ⅱ等活性改变或细胞内酶与药物的亲和力改变导致靶耐药；（4）重要的凋亡相关蛋白，如Bcl-2蛋白家族和肿瘤抑制蛋白P53的表达改变；（5）其他，如穹窿蛋白合成和细胞膜穴样蛋白的过表达等。
4神经酰胺代谢关键酶与多药耐药的关系
Itoh等[10]用0.1μmol 阿霉素处理HL-60/ADR细胞，只显示了微弱的凋亡表现，神经酰胺含量仅少量增高，等量浓度的阿霉素则能诱导HL-60细胞凋亡，伴有神经酰胺含量明显增高。在此条件下，HL-60和HL-60/ADR细胞内DOX浓度无显著区别，提示除了像P-gp一样的药物外排泵外还有与神经酰胺相关的耐药机制。
4.1GCS与P-gp在肿瘤耐药细胞中的表达
在高尔基体的细胞表面， GCS催化UDP-2-glucose上的糖基以β型糖苷键与神经酰胺相结合生成葡糖神经酰胺(glucosylceramide，GlcCer)。虽然神经酰胺能通过直接激活半胱天冬酶（caspase）启动程序性细胞死亡，但其促凋亡活性可被GCS抑制，HL-60/ADR细胞比HL-60细胞神经酰胺水平低，而GCS及SMS活性比HL-60高，过表达GCS的HL-60/GCS细胞明显抑制阿霉素诱导的神经酰胺水平升高和凋亡[10]。
Gouaze等[11]通过检测乳腺癌细胞株MCF-7、表皮样癌细胞株KB-3-1和其他肿瘤细胞株对阿霉素、鬼臼乙叉苷和长春新碱获得性耐药水平，分析了GCS表达和MDR表型的关系。实验表明，GCS的mRNA、GCS蛋白水平随着KB-3-1的亚株KB-V.01，KB-V.1和KB-V1（以MDR水平增高排序）的耐药性增强而增高，P-gp水平相应增高。对阿霉素耐药的KB-3-1亚株KB-A.05和KB-A1中GCS表达水平也增高。研究乳腺癌细胞株野生型MCF-7和耐阿霉素细胞株MCF-7/AdrR发现，GCS mRNA和GCS蛋白、P-gp mRNA和P-gp蛋白均表达增强，与此相应，耐药细胞株可表达高水平的葡糖基神经酰胺。耐长春新碱的白血病细胞、耐鬼臼乙叉苷的黑素瘤细胞及耐阿霉素的结肠癌细胞都检测到相似的结果。在MCF-7/AdrR的GCS启动子活性比MCF-7细胞高15倍，提示药物耐受生物学中，GCS与P-gp可能有某种联系。
通过研究GCS抑制剂PDMP（1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol）对野生型和2株耐药乳腺癌细胞株化疗敏感性差异的影响发现，PDMP的亚毒性浓度使药物选择性耐阿霉素的MCF-7/AdrR细胞株和经多药耐药基因（mdr1）转染的P-gp过表达的MDA435/LCC6MDR1细胞株对紫杉醇和长春新碱的敏感性增强，但没有改变野生型细胞的化疗敏感性。紫杉醇摄取增加表明，PDMP的作用不是改变膜的渗透性，因为PDMP不影响抗肿瘤药物聚集。2种耐药肿瘤细胞株都过表达P-gp，而两者只有MCF-7/AdrR过表达GCS。阻滞P-gp功能，则PDMP在MCF-7/AdrR的功能降低至1/3，而MDA435/LCC6MDR1细胞株没有改变，这意味着神经酰胺的代谢和促凋亡作用不仅受GCS调控，还受到P-gp介导的转运功能调节[12]。
限制GCS活性可以下调MDR1的表达。Gouaze等[13]用紫杉醇处理后，与耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR相比，转染反义GCS mRNA细胞的胞内药物（紫杉醇和长春新碱）水平增加了10倍。此外，细胞内P-gp蛋白表达降低了80％，细胞内神经节苷脂水平降低至1/4。应用GCS化学抑制剂产生和转染反义GCS mRNA相同的作用，与对照组相比，用GCS抑制剂PPMP（1-phenyl-2-palmitoylamino-3-mo rpholino-1-propanol）处理的MCF-7/AdrR细胞，可降低神经节苷脂水平，恢复对长春新碱的敏感性，且对长春新碱的摄取增加了3倍，使mdr1表达降低了58％。在耐长春新碱细胞株KB-V0.01表现出相同的作用，用PPMP处理7 d后，与对照组相比，mdr1表达降低了84％，P-gp蛋白水平降低了50％。用小干扰RNA处理MCF-7/AdrR细胞株，特异性阻滞GCS表达，也使mdr1表达明显降低。
为检测GCS是否可作为肿瘤治疗的靶标，Liu等[14]设计并检验了GCS反义寡脱氧(核糖)核苷酸在MDR肿瘤细胞的基因表达和化学敏感性中的作用。用反义GCS寡脱氧(核糖)核苷酸预处理后，对阿霉素耐药的乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR和卵巢癌耐药细胞株A2780/ADR对阿霉素敏感性分别提高了17倍和10倍，反义GCS寡脱氧核苷酸只使乳腺癌敏感细胞株MCF-7对阿霉素的敏感性提高了3倍，而且不影响阿霉素对正常人类乳房上皮细胞的细胞毒性，证实反义GCS寡脱氧(核糖)核苷酸能阻滞细胞GCS表达并选择性地增强抗肿瘤药物的细胞毒性。
新近的研究显示，抑制GCS活性并不能增强人神经母细胞瘤细胞株对长春新碱的敏感性。Dijkhuis等[15]用2种非常有效的GCS抑制剂t-PPPP（D，L-threo-1-ph enyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol）和NB-dNJ（N-butyldeoxynoj irimycin）耗竭2种人神经母细胞瘤细胞株内的神经节苷酯，经荧光激活细胞分选术分析（FACS）显示，神经节苷酯耗竭只是在相反方向影响了P-gp和MRP介导的药物外排活性，而且此种作用与已明确的MRP（如MK571）和P-gp（如GF120918）抑制因子作用相比还很模糊。用MTT法检测发现，在2种神经母细胞瘤细胞株中t-PPPP 轻微地增强了细胞对长春新碱的敏感性，NB-dNJ 则无明显作用。所以，GCS与肿瘤多药耐药的关系还需进一步研究。
4.2神经酰胺与bcl-2在肿瘤多药耐药中的共调节作用
bcl-2家族作用于凋亡途径的共同下游通道，其家族中诱导凋亡基因（包括bcl-xs，bax，bak）表达的蛋白与抗凋亡基因（bcl-2，bcl-xl等）表达的蛋白比例决定着细胞对各种促凋亡刺激是敏感还是耐受。过表达抗凋亡蛋白或者下调促凋亡蛋白可阻滞细胞色素C从线粒体的释放。bax和bak蛋白从胞浆移位到线粒体外膜，二聚化形成可供细胞色素C释放的孔道。此种作用可被抗凋亡的bcl-2家族成员拮抗，抑制二聚化并减少细胞色素C的释放从而阻断凋亡。此种作用已证实与化疗耐药性相关[16]。细胞内过表达抑制性蛋白，如bcl-2等，能阻滞神经酰胺介导的细胞死亡，而不影响神经酰胺的产生。用抗凋亡蛋白诱导促凋亡二聚体，神经酰胺能逆转bcl-2细胞保护信号而启动细胞死亡。这种细胞保护信号的丢失，可破坏线粒体膜的完整性并导致细胞色素C和凋亡诱导因子的外排[17]。白血病活体内检测显示，化疗不敏感的患者体内神经酰胺水平低于化疗敏感的患者，GCS和SMS活性在化疗耐受患者体内比化疗敏感患者高2倍，并在化疗耐受患者体内检测到bcl-2蛋白，提示白血病化疗耐受通过GCS和SMS活性增高而降低神经酰胺水平与bcl-2相关[10]。
4.3神经酰胺与NF-κB在肿瘤多药耐药中的共调节作用
NF-κB是神经酰胺作用的下游效应因子，中性鞘磷脂酶激活产生神经酰胺是TNF诱导细胞毒性作用的必需步骤[18]，神经酰胺在神经酰胺诱导的NF-κB，AP-1，JNK，MAPK激酶活化和凋亡中是必需的[19]。NF-κB是多亚基核转录因子，调节细胞生长、分化、发育及对氧化还原平衡的适应性反应及凋亡。在胞浆中，NF-κB和它的抑制蛋白I-κB结合成非活性形式。外界刺激包括促炎症反应因子、感染因子、应激和化疗药物等通过使I-κB磷酸化并降解而激活NF-κB，NF-κB转位到核内引起靶基因转录[20]。NF-κB靶基因是促进还是抑制转录取决于激活的刺激特异性信号通路。NF-κB抑制凋亡靶基因包括caspase抑制蛋白IAP家族，TRAF1和TRAF2，后两者能抑制caspase-8，Bfl1/A1，Bcl-XL和诱导性一氧化氮合成酶的激活。文献报道[21]，NF-κB途径能抑制Bax激活。涂刚等[22]通过观察耐药MCF-7/Adr及其药敏亲本系MCF-7乳腺癌细胞中NF-κB的激活水平，和其抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷对耐药的逆转效应发现，与亲本药敏细胞相比，MCF-7/Adr中的NF-κB呈高水平的激活状态。抑制NF-κB激活可部分的逆转MCF-7/Adr的阿霉素抵抗，提示NF-κB参与乳腺癌耐药机制的形成。
5结语与展望
肿瘤细胞遗传的不稳定性，耐药产生的多因素多环节性，个体对化疗反应的差异性和不同耐药机制在同一肿瘤中的并存性显示肿瘤耐药的复杂性，深入研究多药耐药的产生原因可加强对多药耐药产生机制的理解。神经酰胺在不同细胞中表现的生物学效应不同，作为细胞内信号传导的第二信使，其糖基化在多药耐药中的作用是近年才发现的新的耐药机制，已经引起了学者们的重视，利用各种药物和基因阻断技术阻断神经酰胺的糖基化，为多药耐药机制及其逆转研究开拓了新的思路，为临床治疗提供了指导。
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