摘要：【目的】确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官，为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据。【方法】分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察，并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位，明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官。【结果】3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌，其中，腹腔注射和经口灌胃在感染2 h后即出现病理变化，而体外浸泡感染方式出现病理变化的时间约在感染5 h后，且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻。免疫组织化学定位发现，腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠，经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏，体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠。【结论】采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌，其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现。因此，自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施。
关键词： 吉富品系尼罗罗非鱼；无乳链球菌；致病途径；靶器官；免疫组织化学
中图分类号： S941.42 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）02-0375-08
0 引言
【研究意义】无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是广泛存在于自然界中的条件致病菌，可危害水产养殖中的不同鱼类品种，包括罗非鱼（Oreochromis niloticus）、卵形鲳鯵（Trachinotus ovatus）、斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）、石斑鱼（Epinephelus sp.）等（Jafar et al.，2008；Amal et al.，2012；刘溪等，2015；郭长明等，2017；张德锋等，2017）。自2009年以来，随着罗非鱼规模化养殖模式的大面积推广，其病害日趋严重，尤其是无乳链球菌病危害呈逐渐递增趋势。该病死亡率高，传播速度快，但至今尚未找到完全根治的方法。因此，亟待开展罗非鱼抗病品系选育研究以保障其产业的健康持续发展，而开展罗非鱼抗无乳链球菌病育种的前提必须明确罗非鱼对无乳链球菌侵染的免疫应答机制。【前人研究进展】目前，有关病原菌感染鱼类的免疫应答机制研究已有报道。Skirpstunas和Baldwin（2002）研究发现，爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）通过肠道上皮细胞侵入斑点叉尾鮰体内，从而引起肠道败血症；Co-tter等（2005）研究发现，海豚链球菌（Streptococcus iniae）最先感染罗非鱼的胃肠组织，随后通过局部扩散作用进入血液循环系统，最后进入神经中枢系统而引发脑膜炎等症状；Tu等（2010）研究证实，嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）通过肠道感染鲤鱼（Cyprinus carpio），且感染5周后还能从其肠道中分离出病原菌；但郭松林等（2011）研究发现，嗜水气单胞菌感染欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）时最先出现在肾脏组织，随后通过循环系统扩散至全身而引发病症；张永华（2012）采用实时荧光定量PCR检测副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染斑马鱼（Danio rerio）前后IL-1β、IFN和TNF的mRNA转录水平，结果表明，3种炎性细胞因子的表达水平与感染方式密切相关，但随着感染时间的延长均呈先升高后降低的变化趋势；Peatmana等（2013）研究证实，柱状黄杆菌（Flavobacterium cloumnare）感染斑点叉尾鮰的第一靶器官是鳃组织；季策（2017）研究表明，Notch1a在Notch信号通路中可能通过抑制irak家族及NFκB家族基因而抑制TLR通路傳导，在副溶血弧菌感染斑马鱼2 h时负向调节nfkbiaa、cxcl18b、cxcr3、il11r、c3a、cfb、myhb、myh11a、serpinf2a、ctss2和ctslb等基因的表达，进而调控斑马鱼的天然免疫应答机制。【本研究切入点】目前国内有关罗非鱼无乳链球菌病的研究主要集中在病原菌分离鉴定（柯剑等，2010；郭玉娟等，2012）、毒力因子筛选（邓永强和汪开毓，2016；方伟等，2016）、药物防治（华亚南等，2016；梁志凌等，2016）及疫苗研发（李莉萍等，2015；王瑞等，2015）等方面，而针对其致病途径及感染后罗非鱼机体内组织的病理学研究报道甚少。【拟解决的关键问题】通过腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，然后采集感染罗非鱼的鳃、肠、脾脏和肝脏组织进行病理形态学观察，并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位，明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其侵染的靶器官，为吉富品系尼罗罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试吉富品系尼罗罗非鱼取自广西南宁国家级罗非鱼良种场，SPF级成年兔购自广西医科大学实验动物中心，无乳链球菌株（HN016）由广西水产科学研究院鱼病防治研究室保存提供。HN016菌株解冻后直接接种于鸡血培养基上，30 ℃培养18～24 h，长出菌落后随机挑取单个菌落进行革兰氏染色，检测其是否携带杂菌；然后挑取单个菌落接种至200 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，摇床上32 ℃培养24 h，以无菌生理盐水稀释至1×107 CFU/mL，4 ℃保存备用。
1. 2 无乳链球菌感染方式
分别采用腹腔注射、经口灌胃和体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染，感染试验鱼置于3 m3的水体大桶中养殖，水温控制在30～31 ℃，每天投喂膨化饵料2次，每隔3 d换水1次（1/2）。感染后每隔1 h观察统计1次罗非鱼的发病或死亡情况，并及时捞出病鱼、死鱼。
